克氏原螯蝦抗菌肽crustin5基因克隆及其表達分析

李博 王凱 于曉東 劉睿哲 藺思函 商靜 沈秀麗 杜志強

摘要：【目的】深入了解克氏原螯蝦先天免疫過程中抗菌肽的作用與功能，豐富先天免疫中抗菌肽的理論知識，為克氏原螯蝦的病害機理研究及防控措施制定提供參考依據。【方法】從克氏原螯蝦肝胰腺組織提取總RNA，利用PCR擴增crustin5基因全長cDNA序列，運用DNAMAN 6.0、ProtParam、ProtScale、SOPMA和SWISS-MODEL等在線軟件對其進行生物信息學分析，并以實時熒光定量PCR檢測crustin5基因在克氏原螯蝦各組織中的表達情況。【結果】克氏原螯蝦crustin5基因cDNA序列全長954 bp，開放閱讀框（ORF）為429 bp，共編碼167個氨基酸殘基，其編碼蛋白相對分子量為16485.42 Da，理論等電點為8.58，為不穩定的疏水性蛋白。克氏原螯蝦crustin5蛋白具有典型的crustins家族結構特征，包括N端的信號肽，C端的WAP結構域，以及二者間的半胱氨酸富集區;其二級結構中α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和延伸鏈分別占20.36%、7.78%、58.08%和13.77%。crustin5基因在克氏原螯蝦血細胞、肝胰腺、鰓、腸道、肌肉和淋巴器官等6種組織中均有不同程度的表達，以在血細胞中的相對表達量最高，淋巴器官次之，在肌肉組織中的相對表達量最少。【結論】克氏原螯蝦抗菌肽crustin5具有典型的crustins家族結構特征，且主要分布在血細胞和淋巴器官中，說明crustin5是在克氏原螯蝦的血淋巴中參與先天免疫并發揮抗菌作用。

關鍵詞： 克氏原螯蝦;抗菌肽;crustin5基因;先天免疫;表達差異

Abstract：【Objective】To understand the role and function of antimicrobial peptides in the innate immunity of Procambarus clarkii， and enrich the theoretical knowledge of antimicrobial peptides in innate immunity. It provided reference for the study on the mechanism of P. clarkii diseases and the formulation of prevention measures. 【Method】Total RNA was extracted from the liver and pancreas of P. clarkii ， and crustin5 gene cDNA full-length sequence was amplified by PCR technology. And bioinformatics analysis was carried out on it by online softwares including DNAMAN 6.0， ProtParam， ProtScale， SOPMA and SWISS-MODEL. crustin5 gene expression in tissues of P. clarkiiwas detected by qRT- PCR. 【Result】 The study found that the crustin5 gene had a full-length cDNA of 954 bp， an open reading frame（ORF） of 429 bp， and encoded 167 amino acid residues. The predicted molecular weight of the protein was 16485.42 Da， and the theoretical isoelectric point was 8.58. The crustin5 protein was unstable hydrophobic protein. It had the characteristic structure of the crustins family， including the N-terminal signal peptide， the C-terminal WAP domain， and rich in hemicarboxy-lamine between them. The secondary structure of protein， alpha-helix， beta-corner， random curl and extension chain accounted for 20.36%， 7.78%， 58.08% and 13.77% respectively. The crustin 5 gene was expressed to different degrees in six tissues（hemocytes， hepatopancreas， gill， intestinal tract， muscle andlymphoid organs）. The highest expression was in hemocytes， followed by lymphoid organs， andthe lowest in muscle. 【Conclusion】The crustin5 of P. clarkii antimicrobial peptide has the characteristic structure of crustins family， is mainly distributed in hemocytes and lymphatic organs. It suggests that crustin5 plays an antibacterial role in hemolymph and participate in the innate immunity of P. clarkii.

0 引言

【研究意義】近年來，淡水養殖業發展勢頭迅猛，尤其是蝦類養殖，但同時遭受細菌和病毒等病原體的嚴重侵害。克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱淡水小龍蝦，其在感染細菌和病毒時主要依靠先天免疫進行抵抗（韓珂珂，2019）。在先天免疫過程中，克氏原螯蝦會產生一種重要的免疫效應因子，即抗菌肽（Crustin），其對細菌、真菌及病毒等病原體具有廣譜的抑制效果。抗菌肽對不同細菌均具有抑菌活性，尤其對革蘭氏細菌具有很強的殺傷作用（郭慧等，2013;馬春霞等，2017），同時兼具抗病毒作用、免疫調節作用（吳希，2006）及對真菌的殺傷作用（王顯偉，2012）。因此，加強克氏原螯蝦抗菌肽研究，豐富有關先天免疫中抗菌肽的理論知識，對確保克氏原螯蝦養殖業持續健康發展具有重要意義。【前人研究進展】抗菌肽是由DNA編碼合成于核糖體的多肽，不同類型的抗菌肽存在許多相似之處，一般為短肽（30～60個氨基酸），具有強陽離子性[等電點（pI）8.9～10.7]等特點（Ferrer et al.，1996;Boulanger et al.，2006）。第一個抗菌肽是由瑞典科學家Boman等于1980年從蠟樣芽抱桿菌誘導的惜古比天蠶（Hyalophora cecropia）蛹淋巴液中分離獲得（Boman and Steiner，1981），即天蠶素（Cecropins）。此后，諸多學者開始對抗菌肽研究產生興趣濃厚，并在海洋動物中發現了多種新型的抗菌肽（王曉飛等，2019）。Acosta等（2014）在從羅非魚鰓組織分離出的魚素中鑒定獲得3種新的抗菌肽，分別是Orech-1、Orech-2和Orech-3;Doiron等（2018）在雪蟹（Chionoecetes opilio）水解產物中發現5種新的抗菌肽，分別是Arthrodial cuticle protein AMP6.0、I-connectin、Hyastatin、Vitellogenin和Slow-tonic S2 myosin heavy chain。隨著抗菌肽鑒定種類的增加，為抗菌肽家族的研究與發展奠定了基礎。此外，各種抗菌肽間具有相似的結構和特點。Liao等（2013）、Zhong等（2013）分別在夏魯貽貝（Mytilus coruscus）和巴西蝸牛（Achatina fulica）黏液中發現新的抗菌肽，其共同特點是半胱氨酸含量較高;Qu等（2013）在石斑魚（Epinephiu scoioides）中發現一種抗菌肽亞型，也具有半胱氨酸含量較高的特點;Park等（2018）發現的Rip-thanatin與Shenkarev等（2012）發現的Aurelin及Zhang等（2015）報道的蛤蜊抗菌肽具有相似結構，均包含2個α-螺旋區和3個二硫鍵交聯。最主要的共同特點是抗菌肽均具有較強抗菌活性，Wei等（2015）從海蛇中提取獲得的抗菌肽、Salger等（2016）在白鱸魚中發現的抗菌肽及Zhuang等（2017）從石斑魚中鑒定出的抗菌肽，均具有強大的廣譜抗菌活性：I類抗菌肽對細菌和纖毛原生動物表現出廣譜抗菌活性，III類抗菌肽主要表現出抗原生動物活性，II類抗菌肽的抗細菌和原生動物活性則處于I類抗菌肽與III類抗菌肽之間。【本研究切入點】先天免疫是生物體在進化過程中形成的一種天然防御機制，是生物體開啟免疫應答的基礎（高潔等，2016），對進入生物體內的抗原性物質有無選擇性排斥和清除功能（杜欣軍，2007）。無脊椎動物僅依靠先天免疫就能有效抵抗和防御復雜環境中的病原體侵染（孫晨，2011;徐鑫和劉忠淵，2014），抗菌肽是體液免疫中的重要效應分子，但至今有關抗菌肽在克氏原螯蝦先天免疫過程中的作用機理鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】克隆克氏原螯蝦抗菌肽crustin5基因并進行組織表達特性分析，旨在深入了解克氏原螯蝦先天免疫過程中抗菌肽的作用與功能，豐富先天免疫中抗菌肽的理論知識，為克氏原螯蝦的病害機理研究及防控措施制定提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

健康克氏原螯蝦購自內蒙古包頭市友誼水產市場，在實驗室無菌條件下采集其肝胰腺組織，快速置于液氮中保存，用于總RNA提取。總RNA提取試劑盒（TRIzol Total RNA Reagent）、cDNA第一鏈合成試劑盒（Thermo Scientific RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit）、PCR反應套裝試劑盒、DNA純化回收試劑盒、質粒DNA小量提取試劑盒及SYBR Premix Ex TaqTM II均購自寶生物工程（大連）有限公司;DL2000 DNA Marker、DNA Ladder 1kb Marker和實時熒光定量PCR引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設備：高速冷凍離心機（鹽城凱特實驗儀器有限公司），PCR儀（北京線上生物科技有限公司），電泳儀（北京生東科技有限公司），ABI 7500實時熒光定量PCR儀[英濰捷基（上海）貿易有限公司]。

1. 2 總RNA提取

將液氮中的克氏原螯蝦肝胰腺組織取出，利用TRIzol Total RNA Reagent提取總RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用滅菌DEPC雙蒸水稀釋后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1. 3 cDNA合成

根據Thermo Scientific RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit說明，以Oligo（dT）18為引物，將提取獲得的總RNA反轉錄合成cDNA，-80 ℃冰箱保存備用。

1. 4 目的基因PCR擴增

依據本課題組前期的克氏原螯蝦轉錄組測序結果，并參照NCBI已公布的各物種抗菌肽基因序列，設計特異性引物（F：5'-CAGCAGGACGCTGAC GGC-3'，R：5'-TTACCCTGAACAGGGCTG-3'），以cDNA為模板擴增目的基因。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，進行35個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃結束反應。取3.0 ?L PCR擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1. 5 重組載體構建及序列測定

PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，利用DNA純化回收試劑盒進行目的基因回收;用DNA小量提取試劑盒提取大腸桿菌pET-28a質粒載體，以EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內切酶對目的基因和pET-28a質粒載體進行雙酶切，在T4連接酶作用下進行酶聯反應，獲得的重組質粒pET-28a-crustin5轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞;同時提取重組質粒pET-28a-crustin5，繼續轉化BL21（DE3）感受態細胞，篩選陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1. 6 生物信息學分析

1. 6. 1 目的基因序列分析 使用BLAST對目的基因cDNA全長序列進行分析，并通過ExPASy將其翻譯成氨基酸序列。

1. 6. 2 氨基酸序列比對與系統進化樹繪制 使用NCBI中的BLAST對目的基因序列和已知基因序列進行對比，利用DNAMAN 6.0對克氏原螯蝦crus-tin5氨基酸序列與已知的crustin氨基酸序列進行多序列對比分析，并以MEGA 6.0繪制系統發育進化樹，分析其進化關系。

1. 6. 3 目的蛋白理化性質分析 采用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對crustin5蛋白進行理化性質預測分析，包括相對分子量、理論等電點、氨基酸組成、蛋白不穩定指數、脂肪系數及親水性平均系數等，并使用ExPASy中的ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）對crustin5蛋白進行親/疏水性分析。

1. 6. 4 crustin 5蛋白二、三級結構預測 利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分別預測crustin5蛋白二、三級結構。

1. 7 組織差異表達分析

隨機挑取暫養1周的健康克氏原螯蝦（3尾以上），解剖采集其血細胞、肝胰腺、鰓、腸道、肌肉和淋巴器官等6種組織。提取總RNA后反轉錄合成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM II在ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行crustin5基因表達定量分析，以18S rRNA為內參基因。實時熒光定量PCR擴增引物如表1所示，擴增程序：95 ℃預變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，進行40個循環。利用2-??Ct法換算crustin5基因在克氏原螯蝦各組織中的相對表達量。

2 結果與分析

2. 1 克氏原螯蝦crustin5基因的PCR擴增結果

PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示，在500 bp附近有一條單一、清晰的目的條帶，與預期結果（429 bp）相符，表明已成功擴增獲得克氏原螯蝦crustin5基因。

2. 2 重組質粒菌液PCR鑒定結果

以重組質粒pET-28a-crustin5轉化DH5α感受態細胞，經擴大培養后挑取陽性菌落進行PCR鑒定，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，發現在500 bp附近出現一條清晰的目的條帶（圖2），與預期結果（429 bp）相符。提取重組質粒pET-28a-crustin5后將其轉化BL21（DE3）感受態細胞，經菌液PCR鑒定及1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，也獲得一條與預期結果相符的明亮條帶。

2. 3 克氏原螯蝦crustin5基因測序分析結果

重組質粒pET-28a-crustin5轉化BL21（DE3）感受態細胞后，篩選出陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，結果表明，克氏原螯蝦crustin5基因cDNA序列全長954 bp，開放閱讀框（ORF）為429 bp，共編碼167個氨基酸殘基（圖3）。crustin5蛋白具有典型的crustins家族結構特征，包括N端的信號肽（圖中紅色字體部分），C端的WAP結構域（灰色區域部分），以及二者間的半胱氨酸富集區。

2. 4 crustin5氨基酸序列同源性分析結果

根據NCBI中的BLAST對比分析結果，挑選出與克氏原螯蝦物種相近、基因序列同源性較高的crustin氨基酸序列，并利用DNAMAN 6.0進行多序列對比分析，結果（圖4）發現，克氏原螯蝦crustin5氨基酸序列與斑節對蝦Pm-crustin5氨基酸序列、小褐美對蝦Fs-crustin氨基酸序列、圣保羅對蝦Fp-crustin氨基酸序列、日本對蝦Pj-crustin2氨基酸序列、日本對蝦Pj-crustin4氨基酸序列和中國對蝦Fc-crustin氨基酸序列的同源性分別為28.65%、27.27%、26.86%、25.71%、23.46%和21.39%，與遠海梭子蟹Pp-crustin氨基酸序列、鋸緣青蟹Ss-crustin氨基酸序列、紫螯青蟹St-crustin氨基酸序列和中華絨螯蟹Es-crustin1氨基酸序列的同源性分別為19.41%、18.24%、17.65%和17.34%。

2. 5 系統發育進化樹分析結果

基于crustin氨基酸序列同源性構建的系統發育進化樹（圖5）顯示，克氏原螯蝦（crustin5）與小褐美對蝦（Fs-crustin）、圣保羅對蝦（Fp-crustin）、中華絨螯蟹（Es-crustin1）、斑節對蝦（Pm-crustin5）、遠海梭子蟹（Pp-crustin）、鋸緣青蟹（Ss-crustin）、紫螯青蟹（St-crustin）、中國對蝦（Fc-crustin）、日本對蝦（Pj-crustin 2）和日本對蝦（Pj-crustin4）聚類在同一個進化分支上，說明其親緣關系較近，同源性較高。其中，克氏原螯蝦crustin5與中華絨螯蟹crustin1的親緣關系最近。

2. 6 克氏原螯蝦crustin5蛋白理化性質預測結果

使用ProtParam對克氏原螯蝦crustin5蛋白進行理化性質預測分析，結果顯示，克氏原螯蝦crustin5蛋白分子式為C705H1089N213O222S12，相對分子量為16485.42 Da，理論等電點為8.58;從主要氨基酸組成及其含量可知，以甘氨酸（Gly）含量最高，占25.1%，絲氨酸（Ser）占7.2%，丙氨酸（Ala）占6.6%，半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）和蘇氨酸（Thr）均占6.0%;克氏原螯蝦crustin5蛋白不穩定指數為53.27（>40.00），屬于不穩定蛋白;其脂肪系數為56.11。

2. 7 克氏原螯蝦crustin5蛋白親/疏水性預測結果

利用ExPASy中的ProtScale對克氏原螯蝦crus-tin5蛋白親/疏水性進行預測，其總平均親水性系數為-0.074。由圖6可看出，克氏原螯蝦crustin5蛋白的疏水性氨基酸多于親水性氨基酸，故屬于疏水性蛋白。

2. 8 克氏原螯蝦crustin5蛋白二、三級結構預測結果

利用SOPMA預測克氏原螯蝦crustin5蛋白二級結構，結果（圖7）顯示crustin5蛋白二級結構中的α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和延伸鏈分別占20.36%、7.78%、58.08%和13.77%。同時以SWISS-MODEL的自動建模功能對克氏原螯蝦crustin5蛋白三級結構進行預測，發現crustin5蛋白可能存在的三級結構如圖8所示，與其二級結構預測結果一致。

2. 9 crustin5基因在克氏原螯蝦各組織中的分布情況

以18S rRNA為內參基因，采用實時熒光定量PCR檢測crustin5基因在克氏原螯蝦血細胞、肝胰腺、鰓、腸道、肌肉和淋巴器官等6種組織中的表達分布情況，結果（圖9）顯示克氏原螯蝦crustin5基因在6種組織中均有不同程度的表達，以在血細胞中的相對表達量最高，淋巴器官次之，在肌肉組織中的相對表達量最少。

3 討論

I型甲殼肽是信號肽序列與WAP結構域間含一個半胱氨酸富含區的抗菌肽。于愛清（2014）從紅螯光殼螯蝦（Cherax quadricarinatus）血細胞中成功克隆獲得一個重要的抗菌肽，簡稱為Cq-crustin，其氨基酸序列具有I型抗菌肽結構。劉燕等（2018）從墨吉明對蝦（Fenneropenaeus merguiensis）中克隆獲得crustinⅡ基因，并證實其具有典型的crustins家族結構特征。王月（2018）對從擬穴青蟹（Scylla paramamosain）鑒定獲得的2種抗菌肽（Sp-crus3和Sp-crus4）進行比對分析，發現二者均屬于I型甲殼肽。此外，宋呈文（2013）在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）中發現Pt-crustin2和Pt-crustin3氨基酸序列的N端均存在一段信號肽序列，C端則存在一個WAP結構域，且二者間存在一個半胱氨酸富集區。本研究從克氏原螯蝦中成功克隆獲得一條新的crustin編碼基因序列，命名為crustin5。克氏原螯蝦crustin5基因cDNA序列全長954 bp，共編碼167個氨基酸殘基，其編碼蛋白相對分子量為16485.42 Da，理論等電點為8.58。克氏原螯蝦crustin5蛋白結構預測結果顯示，crustin5蛋白具有典型的crustins家族結構特征，包括N端的信號肽，C端的WAP結構域，以及二者間的半胱氨酸富集區。可見，克氏原螯蝦crustin5與上述抗菌肽具有相似的結構。

大多數抗菌肽蛋白都能在血淋巴細胞中高表達。柳峰松（2005）研究發現，crustin基因在中國明對蝦（F. chinensis）的血細胞、鰓和腸道組織中均有表達。劉燕等（2018）采用熒光定量PCR檢測crustinⅡ基因在墨吉明對蝦體內的表達分布情況，發現crustinⅡ基因在血細胞中高表達，而在腸道、鰓、肝胰腺、尾部肌肉、胃、眼柄和心臟組織中的表達量非常低，且存在顯著差異。本研究結果表明，克氏原螯蝦crustin5基因在其血細胞和淋巴器官中的相對表達量也較高，故推測克氏原螯蝦抗菌肽crustin5是一種具有良好抗菌活性的抗菌肽分子，在先天免疫系統中發揮重要的抗菌作用。

4 結論

克氏原螯蝦抗菌肽crustin5具有典型的crustins家族結構特征，且主要分布在血細胞和淋巴器官中，說明crustin5是在克氏原螯蝦的血淋巴中參與先天免疫并發揮抗菌作用。

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（責任編輯 蘭宗寶）