鴨ChREBP基因表達載體構建及其對原代肝細胞和PC3細胞脂質性狀的影響

譚光輝 覃媛鈺 王單單 李萬貴 羅華倫 吳磊 李杰章 張依裕

摘要：【目的】探究鴨原代肝細胞脂質含量與碳水化合物反應元件結合蛋白基因（ChREBP）表達的關聯性，為深入研究ChREBP基因對畜禽脂質代謝的遺傳調控機制提供參考依據。【方法】采用Ⅳ型膠原酶消化法分離孵化21 d的鴨胚原代肝細胞，以DMEM高糖培養基進行培養。利用RT-PCR擴增鴨ChREBP基因編碼區（CDS）序列，構建攜帶His標簽的真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His，通過脂質體法分別轉染鴨胚原代肝細胞和人前列腺癌細胞（PC3）;采用His標簽檢測試劑盒檢測ChREBP基因的表達量，以脂質指標測定試劑盒測定甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）的含量，并分析鴨胚原代肝細胞和PC3細胞中ChREBP基因表達與脂質指標含量的相關性。【結果】以構建的真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His轉染鴨原代肝細胞和PC3細胞均能發出綠色熒光，表明攜帶His標簽的ChREBP基因能在鴨原代肝細胞和PC3細胞中表達。ChREBP基因表達量與鴨原代肝細胞和PC3細胞中的TG、TC和HDL含量均呈極顯著正相關（P<0.01，下同），與LDL含量呈極顯著負相關。【結論】以構建的真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His轉染鴨原代肝細胞和PC3細胞后均能發出綠色熒光，說明ChREBP基因表達對鴨原代肝細胞和PC3細胞中的脂質代謝作用機理相似，可促進細胞脂質累積。

關鍵詞： 鴨;ChREBP基因;鴨原代肝細胞;PC3細胞;脂質代謝

Abstract：【Objective】To explore the relationship between lipid content and carbohydrate response element binding protein（ChREBP） gene expression in primary duck hepatocytes， so as to provide reference for further study of the genetic regulation mechanism of ChREBP gene on lipid metabolism in livestock and poultry. 【Method】Primary hepatocytes of 21-day-old duck embryos were isolated by type IV collagenase digestion and cultured in DMEM high glucose medium. The sequence of duck ChREBP gene coding region（CDS） was amplified by RT-PCR， and the eukaryotic expression vector pEGFP-N3-ChREBP-His with His tag was constructed and transfected into duck embryo primary hepatocytes and human prostate cancer cells （PC3） by liposome method. The expression of ChREBP gene was detected by His label detection kit， and the contents of triglyceride（TG）， total cholesterol（TC）， low density lipoprotein （LDL） and high density lipoprotein （HDL） were measured by lipid index assay kit. The correlation between ChREBP gene expression and lipid index content in primary duck embryo hepatocytes and PC3 cells was analyzed. 【Result】The constructed eukaryotic expression vector pEGFP-N3-ChREBP-His could emit green fluorescence in duck primary hepatocytes and PC3 cells， indicating that ChREBP gene with His tag could be expressed in duck primary hepatocytes and PC3 cells. The expression of ChREBP gene was very significantly positively correlated with the contents of TG， TC and HDL in primary duck hepatocytes and PC3 cells （P<0.01， the same below）， and very significantly negatively correlated with the content of LDL. 【Conclusion】The constructed eukaryotic expression vector pEGFP-N3-ChREBP-His can emit green fluorescence after transfection into duck primary hepatocytes and PC3 cells， indicating that the mechanism of ChREBP gene expression on lipid metabolism in duck primary hepatocytes and PC3 cells is similar， which can promote cellular lipid accumulation.

0 引言

【研究意義】一直以來，家禽養殖均以生產高體重和高飼料轉化率為目標，但隨著社會的發展和人們生活水平的不斷提高，還應考慮生產低體脂肪禽肉及改善禽肉營養價值以滿足消費者的需求。人們的飲食習慣與其自身健康狀況密切相關，膳食高膽固醇和高脂肪酸的食物會增加心血管疾病發病率，同時能引發癌癥患病率（陳士巧，2014;馬志敏和王吉云，2016）。已有研究表明，改善優化膳食脂肪的含量及組成是預防人群代謝性疾病的重要措施（Julibert et al.，2019），在能量平衡的條件下膳食適宜比例脂肪，可增加脂肪酸氧化及飲食介導的熱量生成（夏娟，2016;Navidshad and Royan，2016）。因此，研究脂質代謝調控機制并改善家禽體內脂肪含量對滿足消費者的膳食需求具有重要意義。【前人研究進展】碳水化合物反應元件結合蛋白（Carbohydrate response element binding protein，ChREBP）是糖脂代謝過程中的重要核轉錄因子，能直接調節肝臟糖酵解及脂肪合成，在畜禽肝臟的脂質合成和糖生成過程中發揮重要作用（Tang et al.，2016）。已有研究證實，ChREBP與丙酮酸激酶的葡萄糖反應元件及脂肪酸合成基因相結合而發揮其生物學功能，當機體內攝入過多碳水化合物時，ChREBP能誘導肝臟將多余的碳水化合物轉化為三酰甘油，運送至肝臟外的脂肪組織中貯存（Osatomi et al.，1999）。ChREBP基因在嚙齒類動物和哺乳類動物的肝臟、腎臟、小腸和脂肪組織表達量較高，在其他組織中的表達水平則相對較低;在動物機體中ChREBP的靶基因主要是參與糖酵解和脂質合成的一些酶類，其激活后可促進葡萄糖向脂質轉化（劉長金等，2014;Iizuka et al.，2018）。同樣，ChREBP能被蛋白磷酸酶（PP2A）誘導磷酸化，從而直接作用于DNA，然后協同SREBP-1誘導糖酵解及脂肪生成（Linden et al.，2018）。Jois等（2017）研究發現，肝臟ChREBP基因缺失能導致白色和棕色脂肪組織基因表達發生改變。此外，ChREBP在許多疾病的發展過程中發揮重要作用，如肝癌、肥胖癥、糖尿病和胰島素抵抗等疾病（Iizuka，2017;Sud et al.，2017）。ChREBP在膳食果糖的轉運及轉化為乳酸和葡萄糖的過程中也發揮關鍵作用，直接參與果糖轉運、果糖分解和糖異生等（Oh et al.，2018）。ChREBP基因不僅是肥胖等疾病治療的新靶點，還能介導系膜細胞的炎癥反應和細胞凋亡，參與糖尿病腎病（DN）的發病機制（Jois et al.，2017;陸心雨等，2018;Niwa et al.，2018）。【本研究切入點】至今，有關家禽ChREBP基因在脂代謝方面的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】通過構建鴨ChREBP基因真核表達載體，轉染鴨胚原代肝細胞，探究鴨原代肝細胞脂質含量與ChREBP基因表達的關聯性;同時以鴨ChREBP基因真核表達載體轉染人前列腺癌細胞（PC3），觀測ChREBP基因表達對鴨原代肝細胞和PC3細胞脂質含量的效應是否一致，為深入研究ChREBP基因對畜禽脂質代謝的遺傳調控機制提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

產出7 d內的櫻桃谷鴨種蛋來源于貴州大學動物科學院家禽試驗場，熏蒸消毒后，在貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室進行恒溫孵化（溫度37.8 ℃，相對濕度65%～70%）。PC3細胞由高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室保存提供;OPTI-MEM、胰酶、DMEM高糖培養基及其他常規試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;紅細胞裂解液、抗支原體試劑和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司;His標簽檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司;RT-PCR試劑盒、膠回收試劑盒、感受態細胞菌種、氨芐青霉素粉劑、卡那霉素粉劑、PCR產物克隆試劑盒、質粒提取試劑盒、pEGFP-N3載體、EcoR I和Kpn I限制性內切酶等購自TaKaRa公司;甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Thermo Fisher cDNA逆轉錄試劑盒、TRIzol試劑盒和Ⅳ型膠原酶購自Invitrogen公司。

1. 2 鴨胚原代肝細胞分離培養及PC3細胞培養

無菌條件下將孵化21 d的胚蛋棄蛋殼去除羊水等黏液，解剖取出鴨胚肝臟，雙抗PBS清洗肝臟，以消毒處理的眼科剪剪碎肝臟組織，然后采用Ⅳ型膠原酶消化法分離鴨胚原代肝細胞，以DMEM高糖培養基進行培養（羅華倫等，2018）。對凍存于液氮中的PC3細胞進行復蘇和鋪板培養，貼壁長滿后以0.25%胰蛋白酶進行消化，并接種至48孔板，置于5% CO2、37.0 ℃條件下進行培養。

1. 3 ChREBP基因擴增引物設計與合成

1. 4 肝臟總RNA提取及RT-PCR擴增

采用TRIzol法提取鴨胚肝臟總RNA，以2%瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度檢測儀NanoDrop 2000（美國NanoDrop公司）聯合檢測總RNA濃度，稀釋至100 ng/μL備用。Thermo Fisher cDNA逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，PCR反應體系50.0 μL：Es Taq Master Mixture（5 U/μL）20.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，RNase-free ddH2O 24.0 μL。擴增程序;95.0 ℃預變性10 min;95.0 ℃ 50 s，60.0 ℃ 50 s，72.0 ℃ 60 s，進行35個循環;72.0 ℃延伸10 min，-20.0 ℃保存。

1. 5 真核過表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His構建

對PCR產物進行純化回收，利用pUCm-T載體構建重組質粒pUCm-T-ChREBP，經雙酶切鑒定、菌液PCR擴增及測序驗證后，以EcoR I和Kpn I雙酶切pEGFP-N3載體和重組質粒pUCm-T-ChREBP，回收目的片段，T4連接酶作用下將攜帶有EcoR I和Kpn I黏性末端的pEGFP-N3與ChREBP基因進行連接并轉化DH5a感受態細胞，鋪板培養18 h后挑取單菌落，再經搖床（37.0 ℃、200 r/min）培養14～16 h，提取真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His，通過雙酶切鑒定、菌液PCR擴增和測序分析進行驗證，-80.0 ℃保存備用。

1. 6 重組質粒pEGFP-N3-ChREBP-His轉染鴨原代肝細胞和PC3細胞

鴨原代肝細胞和PC3細胞各設9個處理組，每組均為3個重復，采用脂質體3000轉染試劑盒將真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His分別轉染匯合度在70%和80%以上的鴨原代肝細胞和PC3細胞，轉染48 h后倒置熒光顯微鏡觀察鴨原代肝細胞和PC3細胞中是否發出熒光及真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His的轉染效率。

1. 7 鴨原代肝細胞和PC3細胞脂質性狀測定及統計分析

以0.25%胰蛋白酶對轉染48 h的鴨原代肝細胞和PC3細胞進行消化，采用血細胞計數板進行計數，調整為106/mL后進行離心沉淀和裂解，利用His標簽檢測試劑盒檢測ChREBP基因的表達量;采用脂質指標測定試劑盒分別檢測鴨原代肝細胞和PC3細胞中的TG、TC、HDL和LDL等4個脂質指標。使用Excel 2013整理數據，以SPSS 20.0進行相關分析。

2 結果與分析

2. 1 鴨原代肝細胞分離及培養效果

初分離獲得的鴨原代肝細胞為圓形，透亮呈云霧狀（圖1-A），即分離效果良好。臺盼藍染色結果（圖1-B）顯示，鴨原代肝細胞活率較高，在85%以上;活細胞著色淺，晶瑩透亮，死亡細胞則被染成藍色，著色深。倒置顯微鏡下觀察發現，接種培養12 h的鴨原代肝細胞出現少量細胞貼壁（圖2-A），培養24 h后出現雙核或多核結構（圖2-B），說明貼壁細胞已開始增殖分裂，培養至48 h肝細胞貼壁狀態良好（圖2-C）。

2. 2 PC3細胞培養效果

將冷凍復蘇的PC3細胞進行鋪板培養，待其長滿培養瓶，用胰蛋白酶消化并進行接種培養，培養12 h后PC3細胞開始出現貼壁狀態，24 h后細胞體積逐漸擴大，貼壁狀態的細胞逐漸增多（圖3）。

2. 3 真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His構建

以EcoR I和Kpn I雙酶切pEGFP-N3載體和重組質粒pUCm-T-ChREBP，純化回收攜帶黏性末端的目的片段，T4連接酶作用構建真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His，經雙酶切鑒定、菌液PCR擴增及測序驗證，結果（圖4）表明已成功構建獲得真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His。

2. 4 真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His轉染鴨原代肝細胞和PC3細胞的效果

鴨原代肝細胞（圖5-A）和PC3細胞（圖5-B）匯合度分別達70%和80%以上時，用真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His進行轉染，培養48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察其轉染情況，結果顯示，經真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His轉染后鴨原代肝細胞（圖5-C）和PC3細胞（圖5-D）均能發出綠色熒光，且效果良好，表明攜帶His標簽的ChREBP基因能在鴨原代肝細胞和PC3細胞中表達。

2. 5 ChREBP基因表達與鴨原代肝細胞脂質性狀的相關性

測定真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His轉染鴨原代肝細胞中的TG、TC、HDL和LDL等脂質指標含量及ChREBP基因表達量，結果顯示在9個處理組中均能檢測到4個脂質指標及ChREBP基因表達（表1）。相關分析結果表明，ChREBP基因表達量與TG、TC和HDL含量呈極顯著正相關（P<0.01，下同），與LDL含量呈極顯著負相關（表2），說明ChREBP基因表達對鴨原代肝細胞脂質沉積起調控作用。

2. 6 ChREBP基因表達與PC3細胞脂質性狀的相關性

由表3可知，在9個處理組中均能檢測到4個脂質指標及ChREBP基因表達（表3）。相關分析結果表明，ChREBP基因表達量與PC3細胞中的TG、TC和HDL含量呈極顯著正相關，與LDL含量呈極顯著負相關（表4），揭示鴨ChREBP基因表達對PC3細胞中的脂質代謝有影響，且其影響機制可能與鴨原代肝細胞的相似。

3 討論

肝臟糖脂代謝受到復雜的新陳代謝信號網絡影響，胰島素、胰高血糖素和腎上腺素等激素通過調節糖脂代謝相關酶的表達及其活性，而控制糖原生成和分解、脂肪酸合成和氧化的相互轉換（Jones，2016）。ChREBP和肝臟X受體（LXR）是肝臟中脂肪生成轉錄調控的關鍵參與者，雙敲除小鼠LXR能減少攝食誘導核O-連接的N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）信號，從而減少脂肪沉積，即LXR在肝臟的葡萄糖利用與脂質合成中發揮重要作用（Fan et al.，2017）。ChREBP基因是肝臟和脂肪組織中脂肪生成的主要調節因子，且在多種細胞類型中作為響應環境和激素信號的中樞代謝協調器而發揮作用（Abdul-Wahed et al.，2017），對人類健康和疾病發生具有廣泛的影響。Iizuka和Horikawa（2008）研究發現，ChREBP在脂質代謝中通過抑制脂肪酸氧化以降低血漿酮水平，可用于治療非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和高脂血癥。ChREBP基因可通過防止膽固醇合成及ChREBP同源蛋白介導的促凋亡折疊蛋白反應而提供葡萄糖（Zhang et al.，2017）;而小鼠肝細胞中胰島素的新信號級聯Pak1/MEK/ERK/Oct-1通過促進肝臟ChREBP產生以降低葡萄糖水平（Zeng et al.，2017）。此外，在1型糖尿病小鼠腎臟中發現胰島素可上調糖尿病小鼠腎臟FAS和ChREBP基因的表達水平（王冰等，2016）。可見，ChREBP基因與葡萄糖及其引起的多種糖脂代謝疾病存在密切聯系。

肝臟是碳水化合物和TG合成的主要場所，可將過量的碳水化合物轉化為脂肪儲存起來或供給機體能量。唐慧（2010）研究證實，對水禽鴨和鵝進行短期填飼碳水化合物如玉米可導致大量TG沉積于肝臟，即導致肝脂肪變性。TG具有供給和儲存能源的功能，可固定和保護內臟。本研究以真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His轉染鴨原代肝細胞和PC3細胞后發現，ChREBP基因真核表達載體在PC3細胞中的表達量高于ChREBP基因，可能是PC3細胞的脂質代謝不同于正常細胞，在高速分裂和增殖過程中需要脂質裝配細胞膜。相關分析結果表明，ChREBP基因的表達與TG、TC和HDL含量呈極顯著正相關，與LDL含量呈極顯著負相關，與Iizuka等（2018）的研究結果一致。LDL是一種運載膽固醇進入外周組織細胞的脂蛋白顆粒，當其過量時攜帶的膽固醇會積存在動脈壁上，而極易引起動脈硬化。HDL可將膽固醇轉化為膽汁酸或直接通過膽汁從腸道排出，是一種抗動脈粥樣硬化的血漿脂蛋白。本研究結果表明，ChREBP基因表達能增加TG合成酶類的轉錄活性，造成機體內脂肪酸代謝失衡，血液中脂類物質增加，促使肝臟胰島素抵抗、脂肪變性及血脂異常等疾病的發生發展。Tong等（2009）、耿西林等（2016）研究表明，ChREBP基因表達異常是促進肝臟腫瘤的主要因素之一，且對結腸癌和肝癌的細胞糖酵解與脂肪酸合成起正調控效應;張明捷和陳寒蓓（2018）研究發現，特異性敲除小鼠肝細胞ChREBP基因后能明顯改善其脂肪肝及胰島素抵抗。說明ChREBP基因的敲除與變異對糖尿病和腫瘤等疾病有明顯影響。本研究結果表明，鴨ChREBP基因表達對PC3細胞中的脂質代謝有影響，且其影響機制可能與鴨原代肝細胞的相似，即具有促進脂質代謝的作用。因此，在研究鴨ChREBP基因的遺傳調控機制時，通過抑制ChREBP活性可防止高碳水化合物產生過多的脂肪沉積，為促進鴨肉品質改良提供參考。

4 結論

以構建的真核表達載體pEGFP-N3-ChREBP-His轉染鴨原代肝細胞和PC3細胞后均能發出綠色熒光，說明ChREBP基因表達對鴨原代肝細胞和PC3細胞中的脂質代謝作用機理相似，可促進細胞脂質累積。

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（責任編輯 蘭宗寶）