響應面法優化番木瓜葉總黃酮提取工藝

呂金慧 馬潔 王府潤 于靖 陳萍

摘要：【目的】利用響應面法優化番木瓜葉總黃酮的超聲波輔助提取工藝，為番木瓜葉中黃酮類成分提取及番木瓜葉綜合開發利用提供技術支持。【方法】利用超聲波提取番木瓜葉片總黃酮，采用氯化鋁顯色法測定總黃酮含量，選取乙醇體積分數（A）、料液比（B）、超聲波時間（C）和超聲波溫度（D）為試驗因素，總黃酮提取率（Y）為響應值，在單因素試驗的基礎上進行Box-Behnken中心組合試驗設計，建立回歸方程，優化總黃酮提取工藝。【結果】建立的回歸方程：Y=4.54-0.11A+0.29B+0.023C-8.333×10-4D-0.18AB+0.19AC-0.068AD+0.23BC+0.017BD+0.18CD-1.13A2-0.72B2-0.44C2-0.61D2。4個因素對番木瓜葉總黃酮提取率的影響排序為料液比>乙醇體積分數>超聲波時間>超聲波溫度，兩因素間的交互作用以料液比與超聲波時間的交互作用對總黃酮提取率影響最大，而料液比與超聲波溫度的交互作用影響最小。最佳提取工藝條件：乙醇體積分數79%、料液比1∶72（g/mL）、超聲波時間42 min、超聲波溫度50 ℃，實際總黃酮提取率為4.15%，與理論預測值（4.18%）接近。【結論】采用響應面法優化超聲波輔助提取番木瓜葉總黃酮的工藝條件穩定可行，可在生產實際中推廣。

關鍵詞： 番木瓜;葉片;總黃酮;超聲波提取;響應面法

Abstract：【Objective】The response surface methodology（RSM） was used to optimize the ultrasonic-assisted extraction process of total flavonoids in papaya leaves，providing technical support for the extraction and separation of flavonoids in papaya leaves and the comprehensive development and utilization of papaya leaves. 【Method】Ultrasound-assisted extraction of total flavonoids from papaya leaves was carried out. The total flavonoids content was determined by AlCl3 chromogenic method.? The volume fraction of ethanol（A）， the material-liquid ratio（B）， ultrasonic time（C），and? ultrasonic temperature（D） were selected as different experimental factors. Based on the experiment of single factor，the combined experimental design of Box-Behnken center was carried out. Establishing regression equation to optimize the extraction process of total flavonoids. 【Result】Established regression equation：Y=4.54-0.11A+0.29B+0.023C-8.333×10-4D-0.18AB+0.19AC-0.068AD+0.23BC+0.017BD+0.18CD-1.13A2-0.72B2-0.44C2-0.61D2. The influence order of the four factors on yield of total flavonoids in papaya leaves was material-liquid ratio>ethanol volume fraction>ultrasonic time>ultrasonic temperature. The interaction between the material-liquid ratio and the ultrasonic time had the greatest effect on the extraction rate of total flavonoids， and the interaction between the material-liquid ratio and the ultrasonic temperature had the least effect. The optimal process conditions were：ethanol volume fraction 79%，solid-liquid ratio 1∶72（g/mL），ultrasonic time 42 min，and ultrasonic temperature 50 ℃. The actual verification value of the total flavonoid extraction rate was 4.15%，which was close to the theoretical prediction（4.18%）. 【Conclusion】The response surface method is used to optimize the ultrasonic-assisted extraction of the total flavonoids in papaya leaves，which is stable and feasible，and can be popularized in production.

0 引言

【研究意義】番木瓜（Carica papaya L.）為番木瓜科番木瓜屬植物，原產于中美洲地區（Liu et al.，2018），被稱為“嶺南果王”（周常清等，2014）。番木瓜含有豐富的營養成分，具有一定的藥用和食用價值（Ikram et al.，2015），其乳液可治療燙傷、潰瘍等病癥，提高人體免疫力和抗病原體（Saeed et al.，2014），其果實可制作瀉藥（de Oliveira and Vitória，2011）。番木瓜中富含的總黃酮具有很強的抗氧化、消炎和抑菌能力（肖健和譚恩靈，2012）。黃酮類物質是一種天然植物產生的次生代謝產物（Routray and Orsat，2012），有降低膽固醇、預防老年人高血壓和腦出血等功效（侯學敏等，2013）。番木瓜中的黃酮類化合物還具有抗腫瘤作用（Otsuki et al.，2010）。番木瓜葉片中富含黃酮類物質，因此，優化番木瓜葉中總黃酮的提取工藝，不僅能有效提取總黃酮成分，節約成本，還可更好地利用番木瓜植株葉片，減少環境污染。【前人研究進展】近年來，許多學者開始研究番木瓜中生物活性成分。李澤友等（2011）利用氣相色譜法檢測到番木瓜種子中的異硫氰酸芐酯含量最高;汪修意等（2013）綜述了近幾年來關于番木瓜中黃酮類物質的研究進展;汪修意（2014）研究發現番木瓜葉和果中均含有番木瓜堿，番木瓜葉中還含有去氫番木瓜堿Ⅰ、去氫番木瓜堿Ⅱ和偽番木瓜堿。對于番木瓜葉有效成分的提取和測定，Owoyele等（2008）研究發現番木瓜葉片的乙醇提取物具有抗炎作用;袁竹連（2013）以丙醇和乙醇為提取劑，提取并測定了番木瓜葉片的葉綠素含量;杜麗清等（2016）利用甲醇作提取劑，研究了番木瓜葉片中總酚的抗氧化活性;但鮮見提取番木瓜葉中總黃酮的研究報道。近年來，響應面法優化超聲波輔助提取工藝被廣泛應用于提取植物葉片總黃酮，如提取枸杞葉（韓愛芝等，2013）、蠟梅葉（徐萌等，2016）、華中枸骨葉（杜銀香等，2019）、柿葉（袁秀平等，2019）的總黃酮。通過超聲波破壞植物細胞壁，讓溶劑進入細胞，酮類物質能充分擴散，從而提高提取效率（Patist and Bates，2008）。【本研究切入點】目前關于番木瓜總黃酮提取工藝的研究較少，利用響應面法（Khuri and Mukhopadhyay，2010）優化超聲波輔助提取番木瓜葉總黃酮工藝的研究更是鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】在單因素試驗基礎上，利用響應面法優化超聲波輔助提取番木瓜葉總黃酮工藝，以期有效提取其總黃酮，為番木瓜葉片綜合開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

番木瓜葉片采自海南大學熱帶農林學院實踐基地，干燥、粉碎后密封備用。氫氧化鈉、氯化鋁、蘆丁、乙醇和亞硝酸鈉均為分析純，購自廣州化學試劑廠。主要儀器設備：新世紀紫外可見分光光度計（T6，北京普析通用儀器有限公司）、臺式高速冷凍離心機（TGL-16S，四川蜀科儀器有限公司）、數顯恒溫水浴鍋（HH-4A，金壇市精達儀器制造有限公司）、超聲波清洗機（KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 標準曲線繪制 參考趙熙等（2010）的方法，并進行一定優化。稱取5 mg蘆丁，用無水乙醇定容至50 mL，得到質量濃度為0.10 g/L的蘆丁溶液，稀釋成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g/L。稀釋后的不同質量濃度蘆丁溶液均按順序依次加入5%亞硝酸鈉0.15 mL，放置6 min;10%氯化鋁0.15 mL，放置6 min;4%氫氧化鈉2 mL和蒸餾水5 mL，靜置15 min;最后在510 nm波長處測吸光值。以標準蘆丁溶液質量濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線。標準曲線方程：y=1.6867x+0.0058（R2=0.9973），線性關系良好（圖1）。

1. 2. 2 番木瓜葉總黃酮提取 稱取一定質量的番木瓜葉粉末，變換不同的反應條件進行提取。

1. 2. 3 番木瓜葉總黃酮測定 參考于靖（2015）的方法，稍作修改。使用1.2.2中提取的樣品，吸取上清液1 mL，根據1.2.1的方法測定樣品吸光值，計算總黃酮提取率。

1. 2. 4 單因素試驗

1. 2. 4. 1 料液比對番木瓜葉總黃酮提取率的影響 稱取0.1 g葉片粉末，超聲波功率200 W，超聲波處理1 h，離心20 min，吸取上清液，比較不同料液比[1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶100、1∶120和1∶140（g/mL，下同）]對番木瓜葉中總黃酮提取率的影響。

1. 2. 4. 2 乙醇體積分數對番木瓜葉總黃酮提取率的影響 根據1.2.4.1優化的結果，超聲波處理1 h，離心20 min，設乙醇體積分數分別為40%、50%、60%、70%、80%和90%。

1. 2. 4. 3 超聲波溫度對番木瓜葉總黃酮提取率的影響 使用優化的料液比和乙醇體積分數，超聲波處理1 h，設超聲波溫度分別為30、40、50、60和70 ℃。

1. 2. 4. 4 超聲波時間對番木瓜葉總黃酮提取率的影響 使用優化后的料液比、乙醇體積分數和超聲波溫度，設超聲波時間分別為20、40、60、80、100和120 min。

1. 2. 5 響應面試驗設計 根據單因素試驗結果確定各因素的水平范圍，以番木瓜葉總黃酮提取率（Y）為響應值，利用Design-Expert 8.0.6進行Box-Behnken試驗設計（傅予等，2017）。Box-Behnken相應試驗的設計因子和編碼值見表1。

1. 3 統計分析

利用Design-Expert 8.0.6進行Box-Behnken試驗設計及數據分析，同時利用Excel 2017進行數據整理和繪制圖表。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果

2. 1. 1 料液比對番木瓜葉總黃酮提取率的影響 由圖2可知，料液比在1∶20～1∶70范圍內，提取溶劑體積不斷增大，番木瓜葉總黃酮提取率逐漸升高，當料液比為1∶70時，總黃酮提取率達最大值（1.23%）;之后提取溶劑體積繼續增大，料液比繼續減小，總黃酮提取率反而降低。綜合節約原料成本和總黃酮物質提取效率兩方面考慮，選擇料液比1∶70為宜。

2. 1. 2 乙醇體積分數對番木瓜葉總黃酮提取率的影響 從圖3可看出，在一定范圍內，番木瓜葉總黃酮提取率隨乙醇體積分數的增加而逐漸升高，乙醇體積分數為80%時總黃酮提取率達最大值（3.09%）。這可能是因為相似相溶，即溶出度最大出現在極性相似時，乙醇體積分數為80%時乙醇和番木瓜葉片有相似的極性;隨著乙醇體積分數的繼續增大，總黃酮提取率有所降低。

2. 1. 3 超聲波溫度對番木瓜葉總黃酮提取率的影響 從圖4可看出，提取開始階段番木瓜葉總黃酮提取率隨著超聲波溫度的升高而增大，溫度為50 ℃時，總黃酮提取率最高（2.98%）;溫度繼續升高，提取率反而降低，可能是溫度過高會造成黃酮類物質部分降解，故選擇50 ℃為最佳超聲波溫度。

2. 1. 4 超聲波時間對番木瓜葉總黃酮提取率的影響 由圖5可知，提取開始時，番木瓜葉總黃酮提取率隨超聲波時間的延長不斷提高，在40 min達最大值（3.06%）;之后隨著超聲波時間的繼續延長，總黃酮提取率逐漸降低。這是因為過長時間的超聲波處理使得溶液溫度逐漸上升，影響了黃酮類物質的相對穩定性，導致提取率降低（吳現芳等，2013） 。因此，選擇40 min為最佳超聲波時間。

2. 2 響應面試驗結果

2. 2. 1 回歸方程建立及方差分析結果 Box-Behn-ken相應試驗的編排組合和結果見表2。通過Design-Expert 8.0.6對表2數據進行方差分析，所得結果如表3所示。番木瓜葉總黃酮提取率（Y）為響應值，利用回歸擬合后，得到回歸方程：Y=4.54-0.11A+0.29B+0.023C-8.333×10-4D-0.18AB+0.19AC-0.068AD+0.23BC+0.017BD+0.18CD-1.13A2-0.72B2-0.44C2-0.61D2。

由方差分析結果（表3）可知，建立的回歸模型P=0.0004<0.01（極顯著），表明本研究方法可靠，對4因素4水平的模擬可行;失擬項檢驗的P=0.0848>0.05（不顯著），表明未知因素對試驗的相關結果影響較小;響應面的決定系數R2=0.8940，表明模型與試驗數據間結合較好，可使用該模型進行番木瓜葉總黃酮提取率的預測（Sin et al.，2006;鄒建國等，2012），可利用此回歸方程確定番木瓜葉總黃酮提取的最優工藝。

由表3可看出，一次項B表現為顯著（P<0.05，下同），其余一次項不顯著（P>0.05，下同），說明料液比對番木瓜葉中總黃酮提取率的影響較大;二次項A2、B2、C2和D2的P均小于0.01，表現為極顯著，說明對總黃酮提取率有較大影響;交互項均表現為不顯著，說明不同因素間的交互作用對番木瓜葉總黃酮提取率的影響較小。4個因素對總黃酮提取率的影響作用排序為料液比（B）>乙醇體積分數（A）>超聲波時間（C）>超聲波溫度（D），交互作用的影響排序為BC>AC>AB=CD>AD>BD。

2. 2. 2 交互作用分析結果 響應曲面圖可詳細且形象地描述各因素間的相互作用（Jang et al.，2017） ，響應曲面坡度越大，說明響應值變化對于改變不同的操作條件越靈敏;曲面坡度越小，說明改變操作條件對響應值的影響越小（劉奉強等，2011）。等高線圖呈圓形，表明不同因素的交互作用影響越小;等高線呈橢圓形，表明不同因素的交互作用影響越大（高丹丹等，2015）。圖6～圖11反映出不同因素交互作用對響應值的變化情況，其中圖9的曲面陡峭，料液比和超聲波時間均為先增后減的變化趨勢，且等高線圖呈現較大的橢圓形，表明料液比與超聲波時間的交互作用對番木瓜葉總黃酮提取率有明顯影響;其次是圖7中超聲波時間和乙醇體積分數所構成的響應曲面也較陡峭，等高線呈較小的橢圓形，表明超聲波時間與乙醇體積分數對總黃酮提取率有一定的交互作用。其余圖中的兩兩交互作用均不明顯，表現為曲面較平緩，等高線基本為圓形，與表3的方差分析結果吻合。

2. 3 總黃酮提取的驗證優化試驗結果

使用Design-Expert 8.0.6計算回歸方程，保證超聲波功率200 W，每次提取0.1 g葉片粉末，3次重復的試驗因素不變，發現超聲波輔助提取番木瓜葉總黃酮的最優條件為：乙醇體積分數79.40%、料液比1∶72.21、超聲波時間41.50 min、超聲波溫度50.17 ℃，預測得到的總黃酮提取率為4.18%。因實際條件具有一定的局限性，對最優條件進行修正：乙醇體積分數79%、料液比1∶72、超聲波時間42 min、超聲波溫度50 ℃。3次平行試驗總黃酮提取率的平均值為4.15%，與模型預測值相近，說明試驗結果與模型擬合良好，通過響應面分析法優化超聲波輔助提取工藝可行。

3 討論

本研究選用對總黃酮提取效率影響較大的4個因素（乙醇體積分數、料液比、超聲波時間和超聲波溫度）作為考察對象，通過單因素和響應面試驗對超聲波輔助提取番木瓜葉總黃酮的工藝條件進行優化。在料液比單因素試驗中，可能是因為隨著提取溶劑的增多，溶劑與番木瓜葉粉間的濃度差增大，傳質速率得到提高;之后，料液比繼續減小，但總黃酮提取率下降，可能是因為溶質體積增大，番木瓜葉中含有的非黃酮類物質溶解度也在增加，而影響總黃酮提取率，總黃酮提取率隨料液比的變化趨勢與周向軍等（2011）提取黃花菜中總黃酮、王波等（2018）提取馬齒莧中黃酮的結果一致。在乙醇體積分數單因素試驗中，隨著乙醇體積分數的增大，總黃酮提取率先升后降，乙醇體積分數與總黃酮的極性相近，乙醇體積分數升高有利于總黃酮溶出;隨后提取率下降可能是由于乙醇體積分數過高會導致某些非酮類物質、色素等其他成分溶解出來，與朱珠和冷進松（2010）提取仙人掌黃酮、高丹丹等（2015）提取薄荷全草中總黃酮的研究結果一致。在超聲波溫度單因素試驗中，番木瓜葉總黃酮提取率呈先升高后降低的變化趨勢，是因為在一定范圍內，溫度升高加快了分子擴散運動速度，達到提高總黃酮提取率的目的，但過高的溫度導致其化學結構受到破壞，降低提取率，與韓愛芝等（2013）提取黑果枸杞葉片總黃酮的研究結果一致。此外，本研究使用超聲波時會導致試驗過程中溫度的變化，需時刻觀察、控制溫度。

利用超聲波輔助提取番木瓜葉中的總黃酮，操作簡易，具有一定的生產應用前景。在單因素試驗的基礎上使用Box-Behnken中心組合實驗設計，得出結果后利用Design-Expert 8.0.6對數據進行分析擬合并建立相應的數學模型，回歸分析結果表明料液比對番木瓜葉總黃酮提取率的影響顯著，料液比與超聲波時間的交互作用對番木瓜葉總黃酮提取率有較大影響。利用響應面法不僅能分析各因素間交互作用對響應值的影響，還可優化番木瓜葉總黃酮提取工藝，預測出最優值，減少不必要的浪費。為更深入地了解番木瓜總黃酮效用，下一步將對提取出的總黃酮作用效果和化學成分等方面進行研究。

4 結論

本研究采用響應面法對超聲波輔助提取番木瓜葉總黃酮的工藝進行優化，得到最佳工藝條件為：乙醇體積分數79%、料液比1∶72、超聲波時間42 min、超聲波溫度50 ℃，實際總黃酮提取率（4.15%）與理論預測值（4.18%）接近。試驗精確度較高，同時操作簡單，且經濟，可用于番木瓜葉總黃酮提取。

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（責任編輯 羅 麗）