白藜蘆醇對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用

汪 雷 胡火軍 馬金陽 董元訓 黃 松 符常濤 袁 高 周有東

腦血管病病人繼發腦功能障礙往往是神經元凋亡和腦微循環損傷的結果[1]。靜脈纖溶酶原激活劑是治療急性缺血性腦卒中唯一有效的藥物[2]，但治療時間窗短，還有潛在的出血風險，只有一小部分病人獲益[3]。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種多酚類植物抗毒素，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及抗癌作用，能透過血腦屏障并發揮神經保護作用[4，5]。有研究報道Res 可以通過介導磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，PKB 或Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路發揮神經保護作用[6]。本研究通過建立大鼠大腦中動脈阻塞缺血后再灌注模型，探討Res 對大鼠腦缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I-R）損傷的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 試劑2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）購自中國醫藥上海化學試劑公司，Res和3-MA均購自美國Sigma公司，PCR試劑盒購自南京Vazyme 公司。兔多抗mTOR 及PmTOR（289 KD）購自美國Affinity Biosciences 公司，兔單抗Akt 及P-Akt（60 KD）均購自美國Cell Signaling 公司，鼠單抗PI3K（85 KD）購自武漢三鷹生物技術有限公司，兔多抗p-PI3K（85KD）購自美國Abcam公司，HRP 標記的羊抗小鼠和羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司，兔多抗GAPDH（37 KD）購自杭州賢至生物有限公司。

1.2 實驗動物及分組SPF級雄性SD大鼠80只，7周齡，體重（250±30）g，由武漢大學動物實驗中心提供（合格證編號：SCXK 鄂2016-0004）。大鼠適應性喂養7 d后，隨機分為假手術組、模型組、Res組和Res+PI3K 抑制劑組，每組20只。

1.3 模型建立和干預 參照Yanamoto等[7]報道的線栓法制備大腦中動脈栓塞模型，缺血2 h，再灌注24 h。造模前6 d，Res 組和Res+PI3K 抑制劑組腹腔注射Res（15 μg/g，1次/d），假手術組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水；造模前30 min，Res 組和Res+PI3K抑制劑組先腹腔注射Res（15 μg/g），然后，Res+PI3K組用微量注射器向右側腦室（前囟點旁開1.6 mm，向后0.9 mm，腔深3.8mm）注射PI3K 抑制劑3-MA 5 μl（50 μg），假手術組和模型組右側腦室注射等體積生理鹽水。

1.4 神經功能評估 造模后21 h，采用Zea Longa評分評估神經功能[8]。

1.5 腦梗死體積的評估 造模后24 h，每組隨機選取4 只大鼠行TTC 染色評估腦梗死體積。麻醉處死大鼠后，取鼠腦置于-20度冰箱冷凍20 min后，取出切片，層厚2 mm[9]。然后，將腦片置于2%TTC 溶液中孵育，完全顯色后將其移入4%多聚甲醛中過夜固定后拍片。為避免因腦水腫產生數據誤差，我們采用梗死面積比[（對側半球面積-患側正常腦組織面積）/對側半球面積]描述腦梗死程度。

1.6 尼氏染色觀察腦組織尼氏體形態 術后24 h，每組隨機選取4 只大鼠以10%水合氯醛麻醉，用生理鹽水和4%多聚甲醛行心臟灌注和組織固定，然后取鼠腦置于4%多聚甲醛中固定48 h，經石蠟包埋、組織切片、脫蠟后，再行1%的甲苯胺藍染色，95%酒精快速分化，脫色，無水乙醇快速脫水，二甲苯透明，尼氏染色，顯微鏡下觀察。

1.7 透射電子顯微鏡觀察自噬體形態 術后24 h，每組隨機選取4 只大鼠以10%水合氯醛麻醉，采用0.9%生理鹽水250 ml 心臟灌注后，再用4%多聚甲醛+2.5%戊二醛混合液250ml 快速灌注固定，然后，快速分離右側半球額頂區皮質，大小約1 mm3，以預冷的2%多聚甲醛和2.5%戍二醛的PBS 混合液4 ℃固定過夜。再用四氧化鋨固定1 h，梯度乙醇脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片（厚度100 nm），并用乙酸鈾和檸檬酸鉛染色，最后在透射電子顯微鏡下觀察。

1.8 PCR 檢測腦組織自噬及凋亡相關基因轉錄水平設計并合成大鼠Beclin1及GAPDH基因（內參照）的PCR引物。術后24 h，每組隨機選取4只大鼠并收集腦缺血周邊區組織約50 mg，分別提取其總RNA 并予以定量檢測。采用逆轉錄試劑盒（南京Vazyme公司）將RNA逆轉錄為cDNA，按其試劑盒操作說明進行PCR 檢測，以2-ΔΔCt法進行量化分析。beclin1正義鏈5'-GAGGTACCGACTTGTTCCCT-3'，反義鏈5'-CCTTTCTCCACGTCCATCCT-3'。內參GAPDH 正義鏈5'- ACAGCAACAGGGTGGTGGAC- 3'，5'- TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

1.9 免疫印跡法檢測mTOR、PI3K、Akt及相應磷酸化水平 術后24 h，每組隨機選取4 只大鼠并分離腦缺血周邊區組織，提取各組織總蛋白，SDS-PAGE分離各蛋白后轉移到PVDF 膜上。將Akt（1:1 000），p-Akt（1:2 000），PI3K（1:4 000），p-PI3K（1:600），mTOR（1:1 000），p-mTOR（1:1 000）相應一抗分別放入封閉液（5%的脫脂奶粉的TBST 溶液）中，4°C 孵育過夜，分別加入辣根過氧化物酶標記二抗（1:50 000），室溫孵2h,最后用增強化學發光顯色，以GAPDH作內參。1.10 統計學分析 采用SPSS 18.0 進行分析；定量數據以±s 表示，用單因素方差分析；P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較 模型組Zea Longa評分[（3.09±0.19）分]明顯高于假手術組[（0.19±0.16）分；P＜0.05]；與模型組比較，Res 組Zea Longa 評分[（1.95±0.24）分]和Res+PI3K 抑制劑組Zea Longa 評分[（2.66±0.22）分]均明顯降低（PP＜0.05），而Res 組和Res+PI3K 抑制劑組之間無統計學差異（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較 假手術組大鼠腦組織未見梗死灶；模型組、Res組和Res+PI3K抑制劑組大鼠右側大腦半球皮層和皮層下可見明顯白色梗死灶，左側大腦半球腦組織呈正常紅色。Res 組和Res+PI3K 抑制劑組腦梗死體積均明顯小于模型組（P＜0.05），而且Res+PI3K 抑制劑組腦梗死體積較Res組明顯增大（P＜0.05）。見圖1。

2.3 各組腦組織尼氏體形態比較 與假手術組相比，模型組尼氏體明顯減少，而且染色加深，形狀不規則。與模型組比較，Res 組和Res+PI3K 抑制劑組尼氏體數量則明顯增加；與Res組比較，Res+PI3K抑制劑組尼氏體數量則相對減少。見圖2。

2.4 各組腦組織自噬體形態比較 假手術組大鼠腦組織細胞質中線粒體、內質網、核糖體等結構清晰，未見明顯自噬泡；模型組可見明顯細胞核固縮、碎裂、深染，胞膜輪廓不清，胞質疏松，可見大量空泡和液化灶，同時可見線粒體腫脹變形，線粒體嵴斷裂；Res 組細胞形態結構基本正常，可見細胞質中線粒體、內質網、和雙層膜自噬體等；Res+PI3K抑制劑組可見少量自噬體和其他細胞器。見圖3。

2.5 各組腦組織自噬相關基因轉錄水平比較 與假手術組相比，模型組Beclin1 mRNA 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，Res組和Res+PI3K抑制劑組Beclin1 mRNA 水平明顯增高（P＜0.05）；與Res 組相比，Res+PI3K抑制劑組Beclin1 mRNA水平明顯降低（P＜0.05）。見圖4。

2.6 各組腦組織自噬相關蛋白表達及其磷酸化水平比較 與假手術組相比，模型組PI3K、mTOR和Akt蛋白表達水平無顯著差異（P＞0.05），而各自蛋白磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）；相比于模型組，Res 組和Res+PI3K 抑制劑組PI3K、mTOR 和Akt 蛋白磷酸化水平明顯下降（P＜0.05）；和Res 組相比，Res+PI3K抑制劑組PI3K、mTOR和Akt蛋白磷酸化水平明顯增加（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

本研究探討Res 對大鼠腦I/R 損傷的神經保護作用，結果發現，Res 可明顯改善腦I/R 損傷大鼠的神經功能，其機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路，促進細胞自噬有關。細胞自噬是一種細胞內的自消化途徑，負責清除長壽蛋白、受損的細胞器和在溶酶體生物合成中形成的畸形蛋白[10]。自噬是真核細胞降解和再循環胞質內容物的主要細胞保護途徑，對機體維持穩態起著重要的作用，適度的自噬可抑制炎癥及凋亡[11]。生理條件下，自噬被觸發以維持體內平衡功能，并在營養缺乏或應激（如I/R損傷）時上調，以提供氨基酸和產生能量。在病理生理條件下，自噬功能障礙的特點是不能清除受損的細胞器或碎片[12]。對I/R損傷后組織自噬的研究表明，受損線粒體的累積導致活性氧生成增加，促進細胞壞死和組織損傷[13]。因此，改善腦組織對I/R損傷的自噬反應可以降低細胞凋亡和壞死水平，保護組織功能。

PI3K/Akt/mTOR 信號通路是促進缺血神經細胞修復和生存的重要信號通路，而且與細胞自噬的激活緊密相關[14]。本研究發現，Res組大鼠神經元內可觀察到自噬體，同時Res 組大鼠腦內自噬相關基因Beclin1 mRNA 表達水平也明顯增高，表明Res 通過促進腦I/R 誘導的自噬水平，從而促進神經元存活；免疫印跡法檢測結果顯示Res 能顯著下調腦I/R 損傷大鼠腦組織p-PI3K、p-Akt、p-MTOR 水平，而PI3K 抑制劑3-MA 能夠削弱Res 的作用。這表明Res 的自噬促進作用可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路來實現的。

綜上所述，Res 可以改善大鼠腦組織I/R 損傷，可能與下調PI3K、Akt、mTOR等蛋白磷酸化水平、抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路、調控細胞自噬水平有關。