熒光光譜法考察β-環糊精-洛伐他汀包合性能

溫福麗，王松濤，2，何 誠，，彭遠松，宋 川

（1.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000；2.瀘州品創科技有限公司，四川瀘州 646000；3.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000）

環糊精（cyclodextrins,CDs）是由α-1,4-糖苷鍵連接多個D（+）-葡萄糖單元形成的中空的環麥芽七糖環狀化合物，是從淀粉中水解得到的一類寡糖，也是一類資源豐富的天然低聚物。外側的C2、C3形成的仲羥基及C6構成的伯羥基使得環糊精具有一定的親水性，內部的空腔則由于C-H 鍵的屏蔽作用而具有疏水性。環糊精在超分子化學中較為廣知的是最有效的主體[1-2]；包合物的形成受客體的理化性質影響較大；比如分子大小、空間結構、電荷狀態以及分子極性等因素[3]。在食品應用中，環糊精包合一些熱不穩定、難溶物質的應用較多[4-6]，β-環糊精由于其廉價、具有適中的空腔尺寸且價格低廉應用最為廣泛。

紅曲酒作為我國華中、華東等地區流行的一種傳統名酒，含有較為豐富的洛伐他汀（圖1），具有較高的營養價值。紅曲菌在發酵過程中能代謝產生γ-氨基丁酸、洛伐他汀、麥角固醇等多種有益物質[7]，功能性紅曲主要成分洛伐他汀（Lovastatin，也稱莫那克林K,Monacolin K,MK）是紅曲霉生成的次級代謝產物之一。洛伐他汀作為一種真菌代謝的天然他汀，在臨床上可作為Hmg-CoA 還原酶的競爭性抑制劑，能有效阻斷人體中的內源性膽固醇的合成，本身也能夠促進膽固醇的分解，具有較好的降脂功效，且無不良反應等作用[8-13]；課題組前期研究表明，洛伐他汀在紅曲酒中能帶來一定的苦澀味，我們期望借助環糊精的微膠囊作用將洛伐他汀的苦澀味掩蓋，改善其食用可接受性。

本實驗采用共沉淀法制備了β-CD-MK 包合物，借助熒光增強法和高效液相法進行了表征驗證。熒光光譜法研究了β-CD 與MK 的主客體包合比、包合常數及熱力學常數并對包埋工藝進行了初步考察；對比高效液相法和熒光增強法的方法學考察，得知兩種方法都能較好的測定洛伐他汀的含量（RSD≤5 %），而熒光光譜法可更靈敏表征β-CDMK 包合物的包合性能，為后期更好地開發口感良好、穩定性更佳的紅曲酒提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

耗材及試劑：洛伐他汀（Monacolin K）標品（99.1%上海安譜試劑，CDAA-280812-20 mg）；β-環糊精（Sigma-Aldrich，St.Louis,MI,USA）；鹽酸（36.5 %,AR 級，成都科龍化工試劑廠）；Na2HPO4（AR 級，成都科龍化工試劑廠）；甲醇/乙醇（色譜級，德國Meker 公司）；乙酸（色譜級，天津市科密歐化學試劑有限公司）；二次蒸餾水。

儀器設備：日立HITACHI F-7000；島津2010高效液相；紫外SP-756P；METTLER TOLEDO電子天平；DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑制備

洛伐他汀標液：準確稱取20.00 mg 試樣于25.00 mL 容量瓶中，乙醇（75 %vol）溶解后定容配制成0.80 mg/mL的MK溶液。

β-環糊精溶液：稱取干燥的β-環糊精1.1350 g用水溶解后定容至100 mL 容量瓶中，配制成10.00 mmol/L β-環糊精溶液。

緩沖溶液：pH7.0的緩沖液：24.40 mL的0.10 mol/L HCl和75.60 mL的0.10 mol/L Na2HPO4[14]。

1.2.2 β-CD-MK包合物的制備[15]

取新鮮配制的MK 20 mg 用少量75%vol 乙醇溶解后和環糊精以物質的量1∶5 配制：將洛伐他汀溶液緩慢加入到環糊精溶液中，磁力攪拌48 h，放入冰箱24 h 后，用0.45 μm 的濾膜過濾（在文獻[15]的基礎上改進），取濾餅常溫干燥后得白色固體包合物及未被包合的液體部分，包合物于4 ℃干燥器中保存備用。

1.2.3 高效液相表征方法及洛伐他汀標曲獲取

新鮮配制MK 用75 %vol 乙醇定容至25 mL，分別取20 μL、60 μL、100 μL、140 μL、180 μL MK標液，甲醇定容至5 mL,0.45 nm膜過濾，進樣10 μL；檢測器：UV（最佳吸收波長238 nm）；高效液相條件（參照QB/T 2847—2007）：HPLC 條件：v=0.65 mL/min，T=45 ℃，流動相：甲醇∶水∶乙酸=385∶115∶0.14；繪制標準曲線，數據擬合獲得標準曲線的線性回歸。取1.2.2 未被包合的上清液測定β-CD-MK 包合物體系的含量，計算包合率。

1.2.4 熒光光譜法獲取λEX/λEM

在10 mL容量瓶中，依次加入MK標準溶液40 μL，環糊精標準液2.00 mL，2.00 mL 緩沖液，用水定容至刻度，25 ℃恒溫加熱磁力攪拌器攪拌15 min 后，在激發波長200～400 nm，發射波長250～500 nm范圍內進行光譜掃描，掃描速度1200 nm/min，EM sampling：1 nm，EX sampling：5 nm，response：0.5 s，EX/EM=5.0 nm，PMT voltage：700 V，獲取包合物的最大發射波長λEM=333 nm 和激發波長λEX=225 nm。

1.2.5 熒光光譜法表征

設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm 范圍分別測定β-CD、MK、以及包合體系的熒光發射譜，比較分析光譜特征，獲得包合體系的熒光表征圖。

1.2.6 熒光光譜法制備β-CD-MK體系標曲

新鮮配制MK 用75 %vol 乙醇定容至25 mL，分別取20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL MK標準容液，加入2.00 mL β-CD環糊精標準容液、2.00 mL緩沖液，用水定容至10 mL，25 ℃恒溫加熱磁力攪拌器攪拌15 min 后，設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm 范圍分別測定F 值。繪制標準曲線，數據擬合獲得標準曲線的線性回歸。取1.2.2 未被包合的上清液測定β-CD-MK 包合物體系的含量，計算包合率。

1.2.7 熒光光譜法考察緩沖液體積對β-CD-MK體系的影響

在10 mL 容量瓶中，依次加入MK 標準溶液40 μL，環糊精標準液2.00 mL，加入緩沖液體積：0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL，用水定容至刻度，25 ℃恒溫加熱磁力攪拌器攪拌15 min 后，設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm范圍分別測定F值。

1.2.8 熒光光譜法考察溫度對β-CD-MK 體系的影響

在10 mL 容量瓶中，依次加入MK 標準溶液40 μL，環糊精標準液2.00 mL，加入緩沖液體積2.00 mL，用水定容至刻度，在溫度為5 ℃、25 ℃、45 ℃、65 ℃、85 ℃下恒溫加熱磁力攪拌器攪拌15 min后，設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm 范圍分別測定F值。

1.2.9 熒光光譜法考察時間對β-CD-MK 體系的影響

在10 mL 容量瓶中，依次加入MK 標準溶液40 μL，環糊精標準液2.00 mL，加入緩沖液體積2.00 mL，用水定容至刻度，在溫度25 ℃下恒溫加熱磁力攪拌器攪拌0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min 后，設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm范圍分別測定F值。

1.3 包合反應比及熱力學常數的測定

在10 mL 容量瓶中，依次加入MK 標準溶液40 μL，環糊精標準液：0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL 緩沖液，用水定容至刻度，25 ℃/45 ℃/65 ℃恒溫加熱磁力攪拌器攪拌15 min 后，設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm 范圍分別測定F 值；按照Benesi-Hilderbrand 方程計算包合比及熱力學常數。

1.4 包合率計算

分別用高效液相法和熒光光譜法所得標準曲線測定包合液上清液中洛伐他汀的含量，計算包合率。

式中：m1為包合液上清液MK 含量；m為客體MK的含量。

2 結果與分析

2.1 高效液相法和熒光光譜法分析

分別將β-CD、MK 標液以及包合物體系在波長250～500 nm 進樣，根據高效液相檢測器窗口可知：MK 及其飽和體系的最大吸收波長λ=238 nm 且在此波長范圍內β-CD 幾乎無紫外吸收，故選λ=238 nm 作為檢測波長，這也與QB/T 2847—2007 建議匹配。結果表明，MK 溶液在pH7 時λ=238 nm 處有最大吸收峰，當加入β-CD 溶液時，最大吸收峰位置不變，同時包合物體溶液的紫外吸收峰明顯高于β-CD 和MK 溶液本身，表明發生了明顯的包合作用[16]。

設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm 范圍分別測定β-CD、MK、以及包合體系的熒光發射譜，結果見圖2。結果表明，當β-CD 加入MK 溶液后，最大發射波長并沒有改變，但熒光強度值明顯增強。分析原因可能是因為MK 分子以非共價鍵范德華力和氫鍵結合β-CD 的疏水空腔，在空腔中，MK分子的運動自由度降低，屏蔽了MK溶液的熒光信號。因此熒光強度的增加可以證明包合物的形成[16]。

2.2 方法學考察

取1.2.2 包合物的上清液分別用高效液相法和熒光光譜增強法考察包合率，并進行方法學考察。

2.2.1 線性考察及靈敏度

以3 倍信噪比為檢出限，10 倍信噪比為定量限進行儀器檢測，高效液相法所獲取MK 標曲：S=46156.24C+34274.43（R2=0.9990，定量限0.45μg/mL，檢測限1.45 μg/mL）；在MK 濃度范圍3.20～28.80 μg/mL 內線性范圍較好；熒光光譜增強法所獲取MK 標曲：F=39020.58C+399.83（R2=0.9962，定量限0.24 μg/mL，檢測限0.98 μg/mL），在MK 濃度范圍1.62～8.10 μg/mL內線性范圍良好，見表1。

2.2.2 精密度試驗

高效液相法：準確量取包合物上清液400 μL，用甲醇定容至5 mL，0.45 nm 膜過濾，進樣10 μL，重復進樣3 次，根據高效液相標準曲線方程求得包合率平均值為60.50 %，RSD 為1.72 %。熒光光譜法考察精密度：準確量取包合物上清液200 μL，加入2.00 mL β-環糊精，2.00 mL 緩沖液加水定容至10 mL，在25 ℃下反應15 min 后測量熒光值F，重復測量6 次，根據熒光光譜法標準曲線方程求得包合率平均值為46.73 %，RSD 為4.28 %。詳細數據見表2。

2.2.3 穩定性試驗和重復性試驗

按照2.2.2 方法，取同一份樣品，分別于0、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h 時分別測量獲得相應的峰面積值和熒光值，每組測6 次并計算相對標準偏差。結果顯示，高效液相法計算所得相對標準偏差為1.69 %，熒光光譜法計算所得相對標準偏差4.58%。

表1 線性方程及靈敏度

表2 精密度試驗結果

表3 加標回收率試驗結果

取同一批樣品6 份，按照2.2.1 方法，測量獲得相應的峰面積值和熒光值并計算相對標準偏差。結果顯示，高效液相法計算所得相對標準偏差為1.73 %，熒光光譜法計算所得相對標準偏差4.83%。

2.2.4 回收率試驗

按照2.2.2 方法考察洛伐他汀的加標回收率與相對標準偏差，樣品加入量為上清液含量的80%、100%、120%加入考察，詳細結果見表3。

方法學考察說明：根據《中國藥典》2015 版總則中對物質含量測定和QB/T 2847—2007 中對功能性紅曲米（粉）的含量測定要求，高效液相法的RSD 均小于2 %，說明方法的精密性、重復性均良好，樣品在24 h 內保持穩定；針對熒光光譜法暫時沒有相應法規要求，但是該實驗結果符合QB/T 2847—2007 中RSD≤±5%的要求，可見兩種方法的結果都準確可靠，適用于研究結果的確定及對產品的質量分析、評價。

2.3 熒光光譜法參數優化

2.3.1 緩沖液體積的優化

通過對包合體系緩沖液體積加入量的考察，在25 ℃恒溫加熱磁力攪拌器攪拌15 min，設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm 范圍分別測定F值。由此得知，隨著緩沖液的加入，當加入量為2.00 mL 之后，熒光強度值變化不大，因此我們選擇加入緩沖液體積2.00 mL 作為實驗測定值，參見圖3。

2.3.2 溫度對包合物的影響

通過對包合體系反應溫度的考察，在5～85 ℃的范圍內加熱磁力攪拌器攪拌15 min，設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm 范圍分別測定F值，由此得知，高溫情況下進行包合時熒光強度值低于低溫下的熒光強度值，反應可能是一個放熱反應，因此我們選擇在室溫即25 ℃作為實驗測定值，參見圖4。

2.3.3 時間對包合物的影響

通過對包合體系時間的考察：在25 ℃恒溫加熱磁力攪拌器攪拌，設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm 范圍內，每隔5 min 測定F 值，由此得知，當反應時間到達10 min 時，熒光強度值變化不大，反應達到15 min 后趨于穩定，因此我們選擇反應15 min作為實驗測定值，參見圖5。

2.3.4 β-環糊精濃度對包合物的影響

通過對β-CD 體積的考察：在25 ℃恒溫加熱磁力攪拌器攪拌15 min，設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm 范圍內分別測定F 值。由此得知，β-CD 體積越大，熒光強度值越大，因此我們選擇2.00 mL的加入量作為實驗測定值，參見圖6。

2.4 熒光光譜法β-CD-MK 包合比及包合常數計算[17]

根據2.3.4 的結果，設定EX=225 nm，在發射波長250～500 nm 范圍內分別測定F 值，在β-CD 的量遠遠大于洛伐他汀的情況下，根據Benesi-Hildebrand 的雙倒數法得包合物的包合常數K，根據擬合情況對包合比進行判斷。假設β-環糊精和洛伐他汀的包合比為n，即MK+[β-CD]n→(β-CD)n-MK，則包合物的包合常數K=[(β-CD)n-MK]/（[MK]×[(β-CD)n]），式中，[MK]、[ β-CD]、[β-CDMK]分別為客體MK，主體β-CD和β-CD-MK的平衡濃度。根據Benesi-Hildebrand 的雙倒數法得：

式中：F 為不同濃度β-CD 的熒光強度，F0為不加入β-CD 時的熒光強度，F∞為包合物的熒光強度。

將實驗數據以1/(F-F0)分別對1/[β-CD]和1/[β-CD]n作圖（n=1,2,3），如果得到線性關系較好的直線則說明其對應的包合比為相應的n 值。當n=1時，F=0.0026c+0.0014（R2=0.9991，n=1,T=25 ℃）；當n=2 時，F=0.0010c+0.0026（R2=0.9654，n=2,T=25 ℃）；F=0.0026c+0.0014（R2=0.9228，n=3，T=25 ℃），β-CD-MK 的雙倒數曲線見圖7，根據擬合情況看，1/(F-F0)和1/[β-CD]n的擬合在n=1 時，呈現較好的線性關系。由此可以確定β-環糊精和洛伐他汀的包合比為1∶1。由斜率和截距計算求得包合常數K=538.50 L/mol，說明β-CD 與MK 形成的包合物較為穩定。且溫度越高，包合常數K 值越小，說明該反應在較低溫條件下更穩定。

在上述基礎上，改變反應溫度，得到不同溫度下的反應包合常數，見圖8和表4。

2.5 熒光光譜法β-CD-MK熱力學參數的計算[18]

標準狀況下，Gibbs 自由能G，焓H，熵值S 有如下關系：

表4 不同溫度下包合物的結合常數

由Van't Hoff等溫式可得：標準狀態下，有ΔG°=ΔH°-TΔS°，由Van' t Hoff 等溫式可得：ΔG°=-RT ln K，則有：ln K=-ΔH°/RT+ΔS°/R，以lnK 對1/K 作圖，由斜率和截距求得ΔH 和ΔS，具體結果見表5，其中，R=8.314×10-3KJ/mol·K。由表5 可知，包合反應的ΔH＜0，ΔS＜0，說明反應為放熱反應，熵增過程；ΔG＜0 且隨著溫度的升高，反應負值減小，說明溫度較低更有利于實驗的自發反應。

表5 包合物的熱力學常數

3 結論

通過熒光光譜法研究了β-環糊精和洛伐他汀之間的相互作用，結果顯示，β-環糊精和洛伐他汀以1∶1 的包合比，包合常數K=538.50 L/mol，且該反應是一個放熱自發反應，為后期開發紅曲酒的包埋工藝提供了理論依據。利用經典的熒光增強法來研究β-環糊精與客體分子的包合作用越來越普遍：因為該方法所需要的試劑相比高效液相法等更為安全，且所需樣品濃度更低。本次實驗中，借用環糊精的熒光增強作用，一個簡單、快速且靈敏度高的用于測定洛伐他汀含量的方法被開發，對比傳統的高效液相法兩種方法的結果都具有一定的可靠性，且熒光光譜法操作簡單，試劑危害小，未來的發展空間會更大，為后期檢驗包埋情況及含量檢測提供技術支持。