醬香型白酒風味形成的影響因素及主體風味成分研究進展

黃 魏，程平言，張 健，李嶺卓，胡 峰

（貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州習水 564622）

醬香型白酒發源于貴州省赤水河流域，生產歷史十分悠久，是以當地糯紅高粱為原料，純小麥曲為糖化發酵劑，經蒸煮、糖化發酵、蒸餾、貯存、勾兌等釀造工藝而制成的。醬香型白酒以醬香風味突出、香氣細膩、口感醇厚、空杯留香持久的特點而為廣大消費者所喜愛。醬香型白酒獨特的風味特征與釀酒微生物和長期實踐總結出來的釀造工藝息息相關。醬香型白酒的生產嚴格遵循“四高三長，一大一多”的傳統釀造工藝（見圖1），在中國主要香型的白酒生產周期最長、工藝最為復雜[1]。正是這樣的釀造工藝造就了主體成分最為復雜的醬香風味，賦予了醬香型白酒更加香濃、醇厚的品質。

關于醬香型白酒風味的研究很早就已經開展，在1964 年針對醬香型白酒代表茅臺酒的第二次試點中，研究人員采用紙上層析法研究茅臺酒窖底香氣成分，成功定性出以己酸乙酯為代表的48 種微量香氣成分[2-3]，初步勾勒出醬香型白酒風味成分的組成特征，拉開了醬香型白酒獨特風味成分研究的序幕。

目前，隨著氣相色譜質譜聯用技術(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、氣相色譜聞香技術(Gas chromatography Olfactometry,GCO)、頂空固相微萃取技術(Headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)等檢測手段的快速發展，針對醬香風味成分的研究步入了新的階段，已經證實醬香型白酒在風味成分的種類以及含量上都要比其他香型的白酒更為豐富，但是對于其主體性風味成分的確定在業內一直存在爭議，目前為止仍未有確切的定論。但從宏觀上來看，如此復雜的風味構成必定與獨特的釀造微生物類群結構、釀造工藝等影響因素密切相關。

本文整理了國內外針對醬香型白酒風味成分的研究文獻，重點分析微生物類群、釀造工藝與醬香風味之間的聯系。從釀造環境中與風味相關的微生物方面入手，描述了各種微生物在醬香型白酒釀造過程中對風味的貢獻，同時也對醬香型白酒在不同釀造工藝階段風味特征的研究現狀進行了綜述。介紹了目前醬香型白酒主體香味成分確立的研究進展，以期為日后特征性醬香香氣構成的深入研究提供理論參考。

1 醬香型白酒中與風味相關的微生物類群

1.1 細菌類群

研究表明，細菌類群在大曲白酒的釀造過程中具有十分重要的地位，尤其在醬香型白酒的釀造中，細菌類群一直被認為是發酵生香的主要動力來源[4]。醬香型白酒長期的開放式制曲、堆積環境形成了獨特的環境細菌菌群結構特征，這些細菌類群結構組成相對固定，各司其職，通過復雜的代謝作用生成各種風味前體以及風味成分，被視為醬香風味產生的根源。因此對醬香白酒釀造環境中細菌類群的風味分析一直是醬香風味研究領域的熱點。

1.1.1 芽孢桿菌類群

芽孢桿菌是醬香型白酒釀造環境中存在量最多，種類最為豐富的細菌類群。由于醬香型白酒高溫度、偏酸性的釀造環境與芽孢桿菌類群的最適生長環境非常契合，導致了芽孢桿菌類群的大量富集[5]。早在1981年，針對該類群在茅臺酒大曲制作中的功能探究便已開展，將大曲中得到的7 株芽孢桿菌純種制曲實驗，發現最終的成品曲帶有明顯的醬香香氣，初步證明了該類群與醬香風味的產生密切相關[6]。目前，在已經分離出的多種芽孢桿菌中，針對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的研究最為廣泛、深入，其余的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus ereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)等類群也均有涉入，基本確定該類群主要的風味代謝產物，揭示出芽孢桿菌在特征性醬香風味形成中的重要作用（見表1）。

總體而言，針對醬香型白酒中與風味相關細菌的研究多集中在芽孢桿菌類群上。通過對不同分離來源的各種芽孢桿菌進行發酵風味分析，基本證實各種芽孢桿菌能夠在醬香白酒釀造過程中代謝產生以3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇、吡嗪類、酯類物質為主的多種風味成分，涵蓋了學術界所討論的醬香型白酒主體香味成分，明確了該類群在醬香風味產生中的重要地位。

1.1.2 其他細菌類群

隨著微生物分離技術的發展，許多過往難以分離的細菌類群也逐漸從醬香型白酒的釀造環境中篩選分離出來。近年來，研究者們針對篩選分離得到的如高溫放線菌屬(Thermoactinomycessp.)[13]、無色桿菌屬(Achromobacterspsp.)、嗜血桿菌屬(Haemophilussp.)[14]以及一些具有耐高溫特性的鏈霉菌屬(Streptomycetesp.)[15-16]進行的風味成分分析發現，這些細菌類群也能夠像芽孢桿菌類群一樣產生吡嗪類風味物質。在萜烯類和酯類風味物質的生成方面，這些細菌的能力甚至略強于芽孢桿菌。此外，對于釀造環境中厭氧細菌的風味研究也已開展。在針對醬香酒醅與窖泥中篩選到的解木聚糖梭菌(Clotridium xylanolyticum)、煎盤梭菌(Clostridium sartagoforme)的固態發酵風味分析中，發現2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪等風味組分的含量較高(≥1%)，初步反映出一些厭氧細菌在醬香風味的產生上也發揮了一定的作用[17]，有效地拓展了學術界對于產醬香細菌類群的認知范圍。

表1 醬香型白酒釀造過程中芽孢桿菌類群的功能性研究

1.2 霉菌類群

霉菌類群一般被認為是釀酒發酵原料中淀粉、纖維素等大分子物質降解的主要動力[18]。在釀造體系中，以曲霉屬(Aspergillussp.)、根霉屬(Rhizopussp.)和毛霉屬(Mucorsp.)為代表的霉菌類群往往能夠產生大量以水解酶為主的活性酶類，有效地促進了大分子原料物質的快速降解，為細菌以及酵母菌的生長代謝提供豐富的前體物質，從而間接地推動了醬香風味的產生[19]。大多數針對醬香白酒釀造環境下霉菌類群的研究都是有關其活性酶代謝和酶活性的研究，直接進行菌種發酵風味分析的研究極少。但是隨著近年來檢測手段的普及以及一些具有產香特征霉菌菌株的成功篩選，使得霉菌類群在釀造體系下的產香功能得到發掘。在針對茅臺酒和郎酒醬香大曲微生物的篩選中，研究者們成功分離出屬于地霉屬(Geotrichumsp.)、木霉屬(Trichodermasp.)、曲霉屬、毛霉屬以及紅曲霉屬(Monascussp.)的菌株，在隨后的發酵產香分析中，發現這些菌株均能代謝產生醬香、果香風味，其中丁二酸二乙酯、油酸乙酯等高級酯類、丁二醇、苯乙醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、糠醛、苯乙醛、乙偶姻為各自發酵產生的主要風味成分[20-21]，初步證實一些霉菌類群在釀造過程中也很可能具有產香的功能。此外，阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)、冠突散囊菌(Eurotium cristatus)作為醬香大曲中新的霉菌類群于近期被篩選分離得到。通過對其風味分析表明，散囊菌也能夠在固態發酵條件下產生以高級醇、酮和呋喃類為主體的揮發性香味物質，賦予發酵物以濃郁的花香和果蔬香[22-23]，證明霉菌類群對醬香白酒風味的生成同樣具有重要的作用。

1.3 酵母菌類群

酵母菌類群在白酒釀造中被稱作產酒的動力來源，在偏酸性的釀造環境中，酵母菌類群能夠快速生長并利用細菌與霉菌代謝產生的前體物質進行酒精發酵，從而完成淀粉、纖維素等生物大分子物質向酒精轉化的釀造過程。釀造環境中分離出的酵母菌類群一般可以分為兩大類：一類是已經得到廣泛研究的產酒酵母；另一類則是以產酯酵母為代表的非產酒酵母[24]。最近，非產酒酵母研究的逐漸開展使學術界對這些酵母功能有了全新的認識。目前已經發現從醬香酒醅中篩選出的平常假絲酵母(Candida inconspicua)、庫德畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)在純種液態、固態發酵中表現出較強的產水果香、花香的能力。其中以乙酸乙酯、亞油酸乙酯、乙酸苯乙酯、2,3-丁二醇、異戊醇、2-庚醇、香葉醇、2-庚酮、庚酸等為主要風味成分[25-27]。在醬香大曲、酒糟中分離到的扣囊復膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、伯頓絲孢畢赤酵母(Hyphopichia burtonii)以及庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)也具有類似的發酵產香特征[28-29]。從代謝的角度看，許多非產酒酵母雖然發酵力較弱，但卻能在釀造體系中產生較高酯化酶活力，在有氧條件下將糖、醇、有機酸等物質轉化為酯、醇、醛等芳香物質，從而在醬香特征風味的形成中發揮一定的作用。

2 醬香型白酒獨特釀造工藝與酒體的風味特征

2.1 高溫制曲

高溫制曲工藝是醬香型白酒釀造過程中的獨特工藝，在整個制曲過程中，曲塊中心溫度最高時可達65 ℃左右，制曲溫度超過50 ℃的時間占到整個過程近2/3，高溫制曲工藝是其他香型白酒所沒有的，因此很多研究者認為獨特的制曲工藝造就特征性的醬香大曲，進而對醬香風味的形成起到了關鍵作用。醬香大曲在釀造過程中起到提供菌源、香氣物質及香氣前驅物的重要作用，其本身也被視為香味富集物，因此分析醬香大曲中的風味成分構成就顯得尤為重要。近年來，GC-O、GC-MS、HSSPME 分析檢測技術發展日益成熟，廣泛應用到醬香大曲風味分析中，明確了醬香大曲為白酒風味富集物的推論。從整體上來看，醬香大曲中發現的風味成分已超百種，但各風味成分之間的含量差異卻比較明顯。不同地域生產、陳化時間不同的醬香大曲風味成分種類及構成也存在較大區別。但總體是以吡嗪類、有機酸類為主導性成分，酯類、醛酮類等風味化合物為微量成分[30-32]。從微生物的角度分析，長時間高溫的制曲環境促進了曲中大量嗜熱細菌的富集生長，這類細菌在高溫環境下能夠利用前體物代謝生成揮發性有機酸類、吡嗪類化合物，賦予醬香大曲獨特的風味特征，為后續白酒醬香的產生提供了物質基礎。

2.2 高溫酒醅堆積

醬香型白酒生產過程中另一個獨特的工藝便是高溫堆積發酵工序。經過高溫蒸糧、蒸酒、冷卻的原料再混入陳化好的大曲之后的酒醅，先置于窖池旁的露天場地上經過一段時間的自然堆積發酵，再投料進入窖池發酵釀造階段。可以說，沒有高溫堆積工藝，醬香型白酒就無法釀造完成，這充分說明高溫堆積的重要作用。酒醅高溫堆積階段在完全開放式的環境下進行，空氣中的大量微生物被網羅、接種至酒醅之中，使得因高溫制曲過程中大量死亡的酵母菌、霉菌等微生物重新在醅料中得以快速富集，增加了整個酒醅的微生物類群結構的多樣性，也促使酒醅的堆積溫度不斷升高。微生物在酒醅發酵過程中降解大分子原料并代謝產生大量風味物質及風味前驅物質，隨著醅料溫度的上升，風味逐漸被釋放出來。

高溫酒醅堆積的實質就是一次各種風味成分再富集的過程，不僅為后續窖池發酵提供了大量的菌源以及風味前驅物，也為最終醬香特征風味的形成奠定了重要的基礎。與醬香大曲不同，醬香型白酒堆積酒醅中已經檢測到近百種揮發性風味成分，主要是以酯類、醇類為主，諸如乙酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、異戊醇等醬香酒體常見風味物質在酒醅香氣成分中均占有較大的比例[33]，推測與產酒、產香酵母菌類群在酒醅堆積過程中大量生長并成為酒醅中優勢微生物類群密切相關。此外，針對不同輪次堆積酒醅的風味特征、堆積過程的存在與否對醬香型白酒風味品質的影響等相關研究也進一步確定了高溫酒醅堆積過程對醬香風格的形成、產酒率有十分積極的作用，并發現第3 輪次、第4 輪次、第5 輪次的堆積酒醅中風味成分最為豐富，這與釀造工藝中這些輪次出酒質量相對較高的特點相一致，再次表明了高溫堆積工藝與白酒品質密切相關[34]。

表2 醬香型白酒獨特釀造工藝及酒體風味特征小結

2.3 高溫流酒

發酵生香，蒸餾提香，高溫流酒是富集香味物質的關鍵步驟之一。除了針對醬香白酒釀造各階段風味成分的分析外，直接對蒸餾出的各輪次基酒酒體或成品酒體進行風味分析也是一種了解白酒醬香風味品質的研究方式。在大量的風味物質被檢出后，通過統計學聚類分析手段對酒體風味物質進行歸類總結，幫助研究者們更加清晰的了解到醬香香氣的具體構成，為醬香風味主體成分的確定提供了良好的依據。

在不同輪次醬香基酒的風味分析中，通過對基酒酒體中59種主要風味成分進行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)，發現同一年份生產的不同輪次的白酒在各種風味構成上存在些許的差異。其中第2輪次、第3輪次、第4輪次、第5輪次的基酒風味主成分比較突出，聚類點集中，不同年份的基酒在主要風味成分的構成上存在明顯的差異[35]。全二維氣相色譜/飛行時間質譜法(Two-dimensional gas chromatography/Time-of-flight mass spectrometry,GC×GC/TOFMS)、GC-O、GC-MS 結合氣味活性值(Odor Activity Values,OAVs)及PCA 等新型分析手段也被運用到成品酒體的風味研究上；在對茅臺成品酒的GC×GC/TOFMS 分析中共檢測出了多達528 種風味組分，通過系統分類確認這些組分包含有機酸、醇、酯、酮、醛、縮醛、內酯、含氮化合物、含硫化合物等[36]，較完整的呈現出茅臺酒酒體特征性風味組分構成，也反映出其風味構成的高度復雜性。在此基礎上，研究者運用GC-O、GC-MS結合OVAs 分析手段從茅臺酒體中確定30 余種具有高氣味活性值的組分，發現乙酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸的含量最高[37]，同時發現與濃香型酒體相比，醬香型白酒酒體中呋喃類、吡嗪類以及碳原子小于4 的脂肪酸、酯類和醇類的含量遠遠高于濃香型酒體[38]，為醬香型白酒主體特征風味的研究打下了良好的基礎。

針對上述醬香型白酒高溫制曲、高溫堆積釀造階段的風味構成以及醬香酒體風味特征進行了小結，具體內容見表2。

3 醬香型白酒主體香味成分分析

3.1 吡嗪類化合物

1981年，研究者便提出制曲過程中產生的強烈醬香氣味很可能與酒體中的醬香風味有著密切的關聯，且隨著制曲溫度的上升，加熱香氣具有更加濃郁的醬香味。經鑒定，大曲加熱香氣組分中的吡嗪類化合物占有很大的比例，因此吡嗪類化合物也一度被認為是醬香型白酒的主體香味成分。吡嗪是一類在1,4 位含2 個雜氮原子的雜環化合物，其化學結構見圖2，在中藥學上具有一定的健康功效。相比于其他香型的白酒，吡嗪類成分豐富是醬香型白酒的重要特征，從酒體中檢測到的四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2,6-二乙基吡嗪等吡嗪類成分含量均高于10 mg/kg，是其他香型白酒含量的10余倍。尤其在茅臺酒中，四甲基吡嗪含量可達到20 mg/kg，是酒體中最主要的風味成分之一[39]。一般來說，醬香型白酒中吡嗪類組分的產生可由美拉德反應、微生物代謝、蛋白質熱解等多種途徑產生。但徐巖等[40]在對白酒中四甲基吡嗪產生機制的研究中證實四甲基吡嗪產生的主要途徑來源于微生物代謝而非其他途徑。最近的研究中，證實了吡嗪類化合物為一類堿性化合物，在白酒偏酸性的環境中是否在風味形成上發揮作用還存在疑問；通過向酒體中添加吡嗪類組分尤其是含量高的四甲基吡嗪，并不能使酒體產生更為典型的醬香香氣[41]。但在針對2-羥甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪的感官導向分離及二維離線高效液相色譜分析中，確定該化合物為醬香型白酒后鼻灼燒焦味的關鍵組分[42]。這說明吡嗪類化合物可能不是醬香型白酒的主體香味成分。但也不可否認其仍是醬香型白酒重要的風味組分、健康因子之一。

3.2 4-乙基愈創木酚

4-乙基愈創木酚是一種高沸點酚類化合物（結構式見圖3），最早被視為醬油制品中的重要的特征性香氣成分，其在醬油釀造過程中的生成機制已經得到較為詳細的論述。在1964 年茅臺酒試點中，研究人員以上述研究為基礎，通過紙色譜分析手段從茅臺酒中檢測到了4-乙基愈創木酚，并在隨后的聞香分析中證實該物質呈臭豆醬氣味，達到中等濃度時會具有類似醬香的風味。因此，提出4-乙基愈創木酚為醬香型白酒特征性風味組分的結論。但隨著后續檢測技術的提升及研究的不斷深入，發現1964 年相關的研究準確性不夠，對4-乙基愈創木酚最新的風味分析、嘗評結果顯示其具有類似薰干的氣味，且在其他香型的白酒中均有存在[43]，推翻了之前得出的結論。因此，學術界不再認定4-乙基愈創木酚是醬香型白酒的特征性主體香味成分。

3.3 呋喃、吡喃類衍生物

呋喃類、吡喃類衍生物（基本結構式見圖4）作為醬香主體香味成分的推論最早在1983 年被提出，當時共有7 種呋喃酮和8 種吡喃酮化合物被列舉為具有醬香風味的組分，認為其可能與白酒醬香風味的形成有關。其中的4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮（HEMF）在醬油中為含量豐富的特征性組分，2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮（DDMP）則在醬香功能菌的發酵液以及啤酒中均有存在。但隨后針對醬香白酒的GC-MS分析、制備物聞香、酒樣添加試驗確定這些物質不是醬香型白酒的特征風味組分。近年來，檢測技術的提升使得越來越多的呋喃類、吡喃類衍生物被準確檢測出來，在醬香大曲、酒醅、酒體中共確定11種該類化合物，包括糠醛、5-甲基-2 糠醛、乙酸糠酯、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛、糠酸乙酯、丙酸糠酯、2-乙酰基-5-甲基呋喃、2-乙氧基-5-甲基呋喃、丁酸糠酯以及糠醇。其中糠醛的含量最高，與其他香型白酒相比，醬香型白酒中檢出的呋喃類物質不但種類多，而且含量非常豐富[44]。整合各種研究結果后，目前可以明確呋喃類、吡喃類衍生物的確是醬香型白酒中重要的呈香物質，但這些組分是否為醬香主體香還缺乏足夠的依據。

3.4 高沸點酸性和低沸點酯類物質

在1982 年的茅臺酒主體香成分研究會上，研究者們提出經反復驗證，茅臺酒的主體醬香可能是高沸點的酸性物質與低沸點的酯類物質組成的復合香。其中低沸點的酯類物質構成了前期酯香，而高沸點的酸性物質是空杯留香的主要來源，為醬香主體香的分析提出了一條新的研究思路[1]。在后續的研究中，通過溶劑抽提、自然揮發、溶解法證實了前期香氣與低沸點物質相關，而空杯香氣中的主要成分為一類高沸點化合物，包括中性、酚類化合物、堿性含氮化合物、有機酸四大類，并通過濾紙條點樣聞香的方式確定其中的酚類化合物呈現空杯香氣，而中性化合物前期呈現酯香，但隨著時間的延長酯味變弱、空杯香逐漸顯現[45]，初步證明了這一觀點的正確性。但是中性、酚類化合物種類十分繁多，究竟是哪些主要物質構成了醬香主體風味目前還未明確，在已經確定的十六酸乙酯、乙酸乙酯、油酸乙酯、苯乙醇、乙醇、乙縮醛等成分已經被證明無法呈現出醬香風味[41]。因此，如何改變這一推論的籠統性的說法，明確具體構成醬香主體香氣的組分結構是今后研究者們需要解決的問題。

3.5 小結

雖然到目前為止，醬香型白酒中主體香氣組分仍未確定，但學者們通過大量研究數據的分析，在總體上達成了一個共識，那就是醬香的主體香氣是由多種物質組成的復合型香味而非某一種或幾種風味組分所構成的。范文來等在此基礎上對醬香主體風味成分的總體特征進行總結，并提出新的猜想，在他們看來，醬香主體香味物質應該是一類沸點相對較高、極性較強、呈酸性或中性、具有醇-脂溶性、濃度很低且閾值極低的物質[41]。這也無疑為今后醬香主體香氣成分的分析研究提供了一定的理論依據，相信在不久的將來，醬香主體香氣之謎一定能夠得到更加明確的闡釋。

4 結語

醬香型白酒以其獨特的醬香風味而聞名于世，從多年研究來看，醬香風味成分的組成以及形成的過程都具有很高的復雜性，所涉及到的物質種類、反應體系非常繁多，這無疑與醬香型白酒諸多的釀造因素的影響密切相關。在本文中，我們對其中的微生物類群、特征性釀造工藝這兩種因素與醬香風味之間的關系進行了較為詳細的論述，可以看出釀造體系中的各種微生物類群結構的變化趨勢與醬香型白酒風味的形成有著高度的相關性，而各種微生物類群結構的變化趨勢又是由醬香型白酒獨特的釀造工藝所決定。醬香型白酒不同微生物作用和不同釀造工藝形成了諸多醬香風味前體或特征性醬香風味成分，這些物質在釀造環境中進一步相互作用并趨于協調，形成獨特的風味結構，最終以高溫蒸餾的方式被帶入到酒體中。

因此，為更加深入地探究醬香風味尤其是醬香主體香味成分的組成，就不能僅僅從風味物質本身入手，應該將醬香風味的形成與獨特的釀造工藝、釀造體系微生物類群結構以及釀造環境等因素緊密結合起來，多方面研究各種因素在醬香風味形成過程中所發揮的作用，這樣才能更為全面的闡釋出醬香物質本質、組成成分和形成機理。此外，隨著研究技術的不斷革新，諸如宏基因組學[46]、環境轉錄組學[47]以及風味主成分分析[48]等手段都開始運用到白酒的研究中來，這也為醬香風味的形成途徑、主體香的判定方面的研究起到了良好的指導作用。醬香型白酒的風味研究，不僅可以揭示醬香型白酒獨特風味組成、代謝機理，還能夠發掘出許多活性功能因子，為日后探究醬香白酒保健功效的相關研究提供了良好的基礎，推動整個醬香型白酒研究領域的快速發展。