應用HS-SPME結合GC-MS分析半固態發酵濃香型酒醅中揮發性成分

劉 曉，劉廣瑞，隋 璐，胡錦榮，張京聲，劉 萍

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.吉林省酒精研究院有限公司，吉林長春 130022)

白酒作為我國傳統的蒸餾酒，是世界七大蒸餾酒之一，無論是生產技術還是產品風格，都具有獨特的地位[1-2]。“曲乃酒之骨，好曲出好酒”，濃香型大曲酒是我國主要白酒香型之一，以瀘州老窖為代表，酒體醇厚綿甜，香味協調，尾凈余長，其主體香味是己酸乙酯與適量的乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯等構成的復合香氣[3-4]。

白酒中各種揮發性成分的含量及其比例關系對白酒品質起著至關重要的作用，目前已在此方面有較多研究[5-7]。此外，對清香型[8]、醬香型[9]和濃香型[10-11]白酒酒醅中揮發性成分變化規律，也有相關研究報道。針對白酒和酒醅的分析研究，發酵方式都遵循傳統的純糧固態發酵方式，對于半固態法釀造濃香型白酒揮發性成分的研究，鮮有報道。馬茹菲等[12]以玉米為主要原料，并按比例添加高粱，探究半固態釀造清香型白酒的最優工藝條件，但是并未對蒸餾酒中的揮發性成分進行分析。

目前，已有報道研究采用頂空-固相微萃取（HS-SPME）結合氣質聯用（GC-MS）法測定酒醅中微量揮發性成分的分析[13-14]。GC-MS 法測定白酒中揮發性成分可以通過保留時間進行定性，以及峰面積歸一法、內標法和外標法等進行定量分析，但是GC-MS對于微量成分的分析存在一定的局限性，容易受到雜質干擾。固相微萃?。⊿PME）技術是新發展的一種樣品前處理方法，靈敏度高、檢出限低且可減少雜質干擾；而頂空固相微萃?。℉SSPME）可以快速、便捷地萃取、吸附揮發性成分和半揮發性成分，結合GC-MS 準確對微量成分進行定性定量分析[15]。范文來等[16-17]應用該技術測定固態濃香型酒醅以及大曲中的微量揮發性成分。張默雷等[18]對比研究HS-SPME 和液液萃取法兩種前處理方式對GC-MS 結果的影響，結果表明，HSSPME處理時揮發性物質種類更多、更全面。

前期研究結合固態釀造和液態釀造兩種發酵方式的優點，進行單因素試驗和正交試驗，分析得到最佳的半固態發酵工藝條件。本研究在最優的工藝條件下進行發酵試驗，采用HS-SPME 結合GC-MS 法對發酵18 d 酒醅中揮發性成分進行分析，為進一步探究半固態法釀造濃香型白酒的發酵機理以及實際生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：脫胚玉米面（天津市寶坻區百立旭糧食加工廠）；高粱為北京市售；增香菌為安琪生香活性干酵母（安琪酵母有限公司）；濃香大曲粉（姜氏養生保健產品公司）。

標物：白酒色譜成分分析標準物質（內標/混標），貴州計量研究院。

儀器設備：LRH-150 生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；TGC-16C 臺式離心機（上海精密科學儀器有限公司）；7890B-5977B 氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫公司）。65 μm PDMS/DVB萃取頭（美國Supelco公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

以玉米和高粱為原料釀造濃香型白酒的工藝條件為：濃香型大曲添加量為原料的30%、增香菌添加量為3.5%、料水比為1∶3.2、溫控條件為第1天28 ℃，第2 天33 ℃，第3 天30 ℃，4～18 d 為25 ℃、發酵時間為18 d。在該工藝條件下，以玉米為主要原料進行半固態法釀造濃香型白酒。

將高粱粉碎至6～8 瓣，粉碎粒度為20 目篩上部分約占70 %；脫胚玉米面要求粒徑過20～40 目篩的比例約為30 %；過40～60 目篩的比例約20 %；過60 目篩部分約占50 %。按比例稱取玉米面和高粱碎（玉米∶高粱=7∶3），分別加入60%冷卻蒸餾水（以總干物料計，下同）混合均勻，進行潤料。高粱碎于室溫條件下潤料12 h，上大汽蒸料4 h，而玉米面于室溫條件下潤料0.5～3 h，大汽蒸料1 h，熟料揚涼至室溫，備用。準確稱取熟料200 g（玉米∶高粱=7∶3）于無菌容器中混合均勻，添加原料30 %的濃香型大曲、3.5 %增香菌、總料水比為1∶3.2、溫控條件為第1 天18 ℃、第2 天33 ℃、第3 天30 ℃、第4～18 天28 ℃，半固態發酵至18 d后，取酒醅進行揮發性成分分析。主要的釀造工藝流程如圖1。

1.2.2 酒醅揮發性成分測定

根據文獻報道的方法[19-20]作適當修改，以最優化的方法對酒醅樣品進行前處理。方法如下：取酒醅樣品10000 r/min 離心8 min，吸取10 mL 上清液置于20 mL 頂空瓶中，加入2.0 g NaCl 和200 μL 內標乙酸正丁酯（乙酸正丁酯質量濃度為17.94 mg/mL），于60 ℃水浴20 min。插入萃取頭，萃取40 min，萃取頭距離液面約1 cm。隨后，在GC進樣口熱解吸5 min（250 ℃）進行GC-MS分析。

色譜條件：色譜柱：（DB-WAX，30 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度：230 ℃，程序升溫：40 ℃，保持3 min，5 ℃/min 升溫至150 ℃，保持5 min，再3 ℃/min 升至230 ℃，保持6 min，進樣方式：不分流進樣（1.0 mL/min），載氣：氦氣（99.999%）[21]。

質譜條件：接口溫度：230 ℃，離子源溫度：230 ℃，離子化方式：EI，電子能量：70 eV，掃描質量范圍m/z：29～500。

2 結果與分析

2.1 揮發性成分的分析檢測

當酒醅樣品發酵至第18 天時，將酒醅樣品離心并取上清液進行GC-MS 分析，酒醅中揮發性成分如表1所示。

采用固相微萃取法，對酒醅中揮發性成分進行萃取、吸附富集。GC-MS 測定時，利用各組分的保留時間不同，對比NIST 數據庫進行定性分析，利用已知含量的內標乙酸正丁酯進行定量分析以及峰面積歸一法計算各組分的相對百分比含量。由于DB-WAX 色譜柱填料主要成分為硅氧烷，剔除檢測結果中含有硅氧烷成分的物質以及匹配因子小于70的物質后，共檢測出48種揮發性物質成分，其中酯類20種，醇類8種，酸類6種，酮類4種，芳香族5 種，其他5 種。酯類和醇類的相對含量較高，分別占總量的37.85%和39.23%，內標乙酸正丁酯占總揮發物質14.92%，定量結果為351.80 mg/L。酯類物質中棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯的相對含量較高，分別為7.83%、4.88%、3.92%、0.77%、0.72%、0.66%、0.64%。醇類物質中乙醇、新戊二醇、丙三醇、異戊醇、(2R，3R)-(-)-2,3-丁二醇的相對含量較高，分別為23.06 %、4.78 %、4.58 %、3.28 %、1.99%。酸類物質中己酸相對百分比為3.04%、含量為71.58 mg/L；乙酸相對百分比為2.53%、含量為59.64 mg/L。酮類物質中3-羥基-2-丁酮的相對百分比為0.16%、含量為3.87 mg/L。芳香類物質中苯乙醇相對百分比較高為4.81%，含量為113.49 mg/L。

2.2 酒醅中揮發性成分分類匯總（見表2）

白酒中揮發性物質成分的量比關系是白酒質量和風格的關鍵因素，同一香型白酒的主體香氣成分應保持一致。檢測結果表明，酯類和醇類的種類和含量均較高，且趨于平衡，該結果與已報道文獻相一致[5，22]。酯類的形成主要有兩種途徑：醇酸酯化和產酯酵母代謝產生。在發酵中后期的酯化階段和產酯酵母代謝階段控制合適的溫度，增強產酯能力。

己酸乙酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯作為濃香型白酒的特征香味成分，含量高低和量比關系決定著濃香型白酒質量和風格。己酸乙酯一般呈菠蘿香和水果香味，賦予酒體獨有的窖香，含量為15.16 mg/L；乳酸乙酯香氣稍弱、微甜，含量為17.01 mg/L；乙酸乙酯具有白酒香氣和甜香，含量為18.27 mg/L。研究報道認為，乳酸乙酯含量和乙酸乙酯含量與己酸乙酯含量之比小于1 時，白酒的品質較好，而本次工藝中“乳己比”為1.12，“乙己比”為1.21。目前我國白酒普遍存在乳酸乙酯含量過高的問題，實際生產時可控制酒窖理化指標、改善微生物菌群等，從而提高白酒品質[23-25]。癸酸乙酯似玫瑰香、蜂蜜香和梨香；亞油酸乙酯也可作為防治動脈硬化、腦血栓等疾病的藥物原料，這為白酒提供保健功能理論基礎[19，22]。此外，辛酸乙酯含量較少，為6.72 mg/L，但已有研究報道通過GC-O 聞嗅技術，證實辛酸乙酯具有明確的水果香，對濃香型白酒復合香氣有促進作用，且香氣強度值（OVA）較大，在酒體中有重要貢獻[26-27]。

醇類化合物具有令人愉快的香氣，乙醇含量最高，醇類總量為543.71 mg/L；2,3-丁二醇醇甜且有強烈的甜香、奶香和濃玫瑰花香，含量為46.86 mg/L；丙三醇味甜、有濃厚感，含量108.10 mg/L。酸類物質是調節白酒口感的重要物質，也是酯類物質的前體物質。其中，乙酸具有強烈酸味，含量為59.64 mg/L；己酸呈奶酪臭味，含量為71.58 mg/L；而性質特殊的乳酸、油酸等物質沒有檢測到。苯乙醇在芳香物質中占有絕對優勢，含量為113.49 mg/L，呈蜜香玫瑰味。苯乙醇通常被認為是米香型白酒的主體香味成分，但在清香型白酒和濃香型白酒中也有大量存在。3-羥基-2-丁酮有強烈奶油香氣、稀釋后呈現令人愉快的香味，其含量為3.87 mg/L。3-羥基-2-丁酮不是酮類中主要香氣成分，但是其還原后可生成醇甜的2,3-丁二醇。

表1 應用HS-SPME-GC-MS法從酒醅中檢測出的揮發性成分

表2 酒醅中揮發性成分分類匯總

3 結論

本研究以玉米和高粱為釀酒原料，添加30 %濃香型大曲，3.5%增香菌，總料水比為1∶3.2，溫控條件為第1 天28 ℃、第2 天33 ℃、第3 天30 ℃、4～18 d 為25 ℃，發酵18 d。采用HS-SPME 結合GCMS 法對發酵18 d 的酒醅中揮發性成分進行分析，結果顯示，共檢測到48種物質，其中酯類20種、醇類8 種、酸類6 種、酮類4 種，芳香族5 種以及其他類5種。濃香型白酒特征性揮發性成分己酸乙酯含量為15.16 mg/L、乳酸乙酯含量為17.01 mg/L 以及乙酸乙酯含量為18.27 mg/L。本研究對于半固態釀造濃香型白酒的實際生產以及探索發酵周期短、酒體醇和、白酒品質優良的新型工藝提供一定的理論指導意義。