姜黃素對糖尿病腎病大鼠腎功能及腎組織JNK、Notch2/hes1信號通路的影響

鄧文榮，石文清，李海俏，周志凌

1珠海市中西醫結合醫院，廣東珠海519020；2珠海市人民醫院

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，若腎損傷未有效控制，可進一步發展為終末期DN，成為糖尿病患者死亡的主要原因。DN表現為腎小球高濾過、腎臟肥大、白蛋白尿甚至膿毒癥[1]。DN早期干預以血壓、血糖控制和飲食干預為主，終末期DN需進行血液透析、腹膜透析、器官移植等干預;然而早期干預控制病情效果有限，透析干預局限性較大且可出現心腦血管意外;器官移植腎源少，可出現排異反應，且并不能防止DN再次發生，對合并癥狀和疾病無明顯改善效果[2]。因此,尋找有效防治DN藥物十分必要。內質網應激是指氧化還原狀態改變和鈣離子平衡紊亂影響內質網引發的內質網細胞自我保護反應，內質網應激是糖尿病早期腎損傷的主要發病機制，其中涉及JNK、Notch2/hes1等多種凋亡信號通路[3]。通過干預這些信號通路來抑制腎臟內質網應激，可能成為DN的有效干預途徑之一。姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的物質，具有抗氧化、消炎作用，用于腫瘤治療、免疫調節和抗腎纖維化等方面已獲得良好效果，且其在DN中的應用也得到研究認可[4，5]。2019年4～7月，我們觀察了姜黃素對DN大鼠的治療作用，以及對腎臟內質網應激介導的凋亡信號通路JNK、Notch2/hes1的影響，探討姜黃素腎臟保護作用的機制，旨在為姜黃素治療DN提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級SD雄性大鼠70只，體質量205～230 g，購自廣州中醫藥大學動物實驗中心。大鼠自由飲水攝食，環境溫度(22±2)℃，相對濕度55%±10%，適應性飼養1周后用于實驗。鏈脲佐菌素(STZ)、姜黃素均購自美國Sigma公司，PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，BCA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。恒溫培養箱購自美國Forman Scientific公司，倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，PCR擴增儀購自美國BIORAD公司。

1.2 動物分組與造模 將大鼠隨機分成正常組、模型組、姜黃素組各20只。模型組和姜黃素組腹腔注射STZ 50 mg/kg(避光溶解于pH 4.28的檸檬酸鈉緩沖液)，7 d后取尾靜脈血檢測空腹血糖，收集尿液檢測尿微量白蛋白、尿肌酐,以血糖水平≥16.7 mmol/L、尿微量白蛋白和尿肌酐顯著高于正常組為造模成功。正常組常規飼養。

1.3 藥物干預 造模成功后，姜黃素組給予姜黃素混懸液(溶解于1%羧甲基纖維素鈉溶液)200 mg/(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予等體積1%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，連續8周。

1.4 血糖及腎功能指標檢測 大鼠腹主動脈采血8～10 mL，1 000 r/min離心5 min，分離血清與血漿，-20 ℃保存待測。采用羅氏血糖儀檢測血糖(GLU)，日立7800型全自動生化分析儀檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血漿白蛋白(ALB)。

1.5 腎組織病理檢查 處死大鼠，取腎組織加入4%甲醛溶液固定，常規行石蠟包埋，切成厚度為4 μm的連續切片。常規行HE及PAS染色，400倍光鏡下觀察腎組織病理變化。

1.6 腎組織JNK、Notch2、hes1 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取大鼠腎組織，TRIzol法提取組織總RNA，逆轉錄合成cDNA。引物由上海生物工程公司設計合成。引物序列：JNK上游5′-TGATGACGCTTACGTGGTA-3′，下游5′-GGCAAACCATTT CTCCCATA-3′；Notch2上游5′-CACCAACTTACGGATTAAACAAGCA-3′，下游5′-TCCGATTCACTGACAACAGACAC-3′；hes1上游5′-TGCTTTCCTCATCCCCAATG-3′，下游5′-GAAGGCGACACTGCGTTAGG-3′；內參β-actin上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTG-3′，下游5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′。反應體系：RNA 5 μg、2×ES Reaction Mix 10 μL、dT18 1 μL、RIES Mix 1 μL，并補水至20 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性0.5 min、64 ℃退火 0.5 min、72 ℃延伸45 s，共33個循環，72 ℃延伸10 min。取PCR擴增產物，常規行瓊脂糖凝膠電泳和成像系統掃描，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。

1.7 腎組織JNK、Notch2、hes1表達檢測 采用Western blotting法。取大鼠腎組織200 mg，冰上研碎，添加Ripa裂解液進行裂解。1 000 r/min離心5 min，取上清液，采用BCA法測定總蛋白質濃度。取5 μL上清液，加入上樣緩沖液，SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，加入一抗，37 ℃搖床孵育2 h，4 ℃孵育過夜。加入二抗羊抗兔IgG-HRP，37 ℃搖床孵育2 h。按照Marker分割硝酸纖維素膜，暗室內曝光。采用Image J 2X軟件分析各條帶平均光密度，以目的條帶與內參β-actin的比值作為蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 三組血糖及腎功能指標比較 與正常組比較，模型組GLU、HbA1c、Scr、BUN水平均升高而ALB水平降低(P均<0.05)；與模型組比較，姜黃素組GLU、HbA1c、Scr、BUN水平下降而ALB水平升高(P均<0.05)。見表1。

表1 三組血糖及腎功能指標比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 三組腎組織病理結果比較 正常腎組織細胞排列緊密，細胞結構完整良好，細胞核清晰，血管上皮細胞為扁平或橢圓形，腎小管上皮細胞呈圓形，核大，于管腔外排列呈環形，腎小管結構保持良好。模型組可見不同程度的腎間質小管片狀壞死，小管上皮細胞腫脹和空泡變性，腎小管上皮細胞壞死脫落，管腔變大，炎性細胞浸潤；姜黃素組也存在上述病理改變，但較模型組明顯改善。

2.3 三組腎組織JNK、Notch2、hes1 mRNA表達比較 與正常組比較，模型組JNK、Notch2、hes1 mRNA相對表達量均升高(P均<0.05)；與模型組比較，姜黃素組JNK、Notch2、hes1 mRNA相對表達量降低(P均<0.05)。見表2。

表2 三組腎組織JNK、Notch2、hes1 mRNA表達比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.4 三組腎組織JNK、Notch2、hes1蛋白表達比較 與正常組比較，模型組JNK、Notch2、hes1蛋白表達水平均升高(P均<0.05)；與模型組比較，姜黃素組JNK、Notch2、hes1蛋白表達水平均降低(P均<0.05)。見表3。

表3 三組腎組織JNK、Notch2、hes1蛋白表達比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討論

糖尿病的發生發展涉及多個生理病理過程，其中自由基引發以及介導的機體氧化應激損傷、機體自由基清除能力下降，而內質網應激誘導的凋亡信號通路與糖尿病導致的心血管系統、腎臟等并發癥密切相關[6]。抑制糖尿病大鼠腎臟Notch通路相關基因表達有助于減少其蛋白尿排泄，緩解病情[7]。姜黃具有破血行氣止痛功效，用于胸痹心痛、痛經、風濕痛、跌撲腫痛等具有良好效果[8]，姜黃提取物姜黃素具有抗氧化、抗癌、抗老年癡呆、抗炎效果[9]。在腎臟病變中，姜黃素可通過抗氧化、促進免疫調節和抗腎纖維化等途徑保護腎組織、改善腎功能，且不良反應較少，安全性較高[10]。

GLU和HbA1c是反映糖尿病病情的重要指標，長期糖代謝紊亂導致GLU、HbA1c水平升高，引起腎小球高血流動力學異常和腎小球高濾過狀態，入球部小血管膨脹。隨著DN的發展，開始出現蛋白尿和腎小球濾過率的降低，尿蛋白增多；進展至腎功能不全失代償期后，由腎小球濾過排泄的肌酐和尿素氮升高，而血漿ALB低水平亦與腎小球濾過率降低密切相關，提示肝臟的合成功能也出現了異常[11～13]。本研究結果顯示，模型組GLU、HbA1c、Scr、BUN水平均高于正常組，ALB水平則低于正常組，腎組織病理檢查顯示不同程度的腎間質小管片狀壞死，小管上皮細胞腫脹和空泡變性，腎小管上皮細胞壞死脫落，管腔變大，炎性細胞浸潤。表明DN大鼠發生腎小管壞死和間質性腎炎，存在嚴重的腎功能損傷。與模型組比較，姜黃素組GLU、HbA1c、Scr、BUN水平明顯下降而ALB水平升高，腎臟組織損傷程度減輕。這表明姜黃素干預有助于控制血糖，改善腎小管濾過功能，從而減輕腎損傷。

研究顯示，抗氧化系統異常是影響糖尿病發生發展的重要機制[14]。氧化還原狀態改變可引發內質網應激，而內質網介導的IRE-1-TRAF2-ASK1-JNK相關通路凋亡信號通路中，磷酸化的IRE-1α與TRAF2相互聚集，激活凋亡信號調節激酶1(ASK1)，形成IRE1α-TRAF2-ASK1復合物，然后激活下游的c-Jun氨基末端蛋激酶(JNK)，進而參與細胞凋亡、增殖、介導炎性反應等過程[15]。本研究結果顯示，模型組腎組織JNK、Notch2、hes1 mRNA及蛋白表達均較正常組升高，進一步證實了內質網應激介導的凋亡信號通路JNK、Notch2/hes1異常可能與DN有關。與模型組比較，姜黃素組腎組織JNK、Notch2、hes1 mRNA及蛋白表達水平降低，提示姜黃素可能通過干預腎臟內質網應激介導的凋亡信號通路JNK、Notch2/hes1達到腎臟保護作用。

綜上所述，姜黃素能夠降低DN大鼠的血糖，改善其腎功能，具有腎臟保護作用；其機制可能是通過抑制腎臟內質網應激介導的凋亡信號通路JNK、Notch2/hes1，抑制腎臟細胞凋亡，從而達到腎臟保護效果。