雷替曲塞對(duì)裸鼠皮下人結(jié)腸癌細(xì)胞移植瘤生長的影響及機(jī)制

賀許良，曾良玉，易小龍，張樹友

1長沙醫(yī)學(xué)院附屬株洲市人民醫(yī)院，湖南株洲412000；2南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院

結(jié)直腸癌是消化道常見腫瘤，據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第三位[1]。目前，結(jié)直腸癌的治療仍以手術(shù)為主，但術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率均較高，特別是對(duì)于中晚期患者而言，手術(shù)治療效果較差，多依賴于化學(xué)治療[2，3]。雷替曲塞是新型抗葉酸制劑，能夠通過競爭葉酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)入細(xì)胞，抑制胸苷酸合酶，損傷DNA，用于惡性腫瘤的抑制治療已取得一定的臨床療效[4，5]。然而，雷替曲塞抑制腫瘤生長的具體分子生物學(xué)機(jī)制尚不完全明確。Bax、Caspase-3、p53均與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，可反映腫瘤的生長狀態(tài)。2018年3月～2019年6月，我們觀察了雷替曲塞對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480移植瘤Bax、Caspase-3、p53 mRNA及蛋白的影響，探討雷替曲塞抑制腫瘤生長的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 1月齡BALB/c雌性裸鼠20只，體質(zhì)量15～20 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境清潔，室溫(25.0±3.0)℃，自由進(jìn)食進(jìn)水。人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購自上海一研生物科技有限公司。雷替曲塞(2 mg/支)由正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，RPMI1640培養(yǎng)基由友康基業(yè)生物科技(北京)有限公司生產(chǎn)，胎牛血清購自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司，兔抗人Bax、p53、Caspase-3單克隆抗體購自美國ABcam公司，羊抗兔β-actin內(nèi)參、BCA蛋白定量試劑盒、EC發(fā)光檢測試劑盒等購自南京凱基生物科技有限公司。自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Bio Tek儀器有限公司，RT-PCR儀購自美國Thermo公司。

1.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立與分組 將SW480細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加入0.25%胰酶蛋白酶消化，制成1×107/mL的單細(xì)胞懸液。取0.2 mL單細(xì)胞懸液注射于裸鼠腋下皮膚。每天觀察裸鼠的狀態(tài)，1周后裸鼠皮下出現(xiàn)直徑5 mm左右的結(jié)節(jié)，表明移植瘤模型建立成功。按照隨機(jī)數(shù)表法將20只移植瘤模型鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10只，實(shí)驗(yàn)組注射雷替曲塞7.5 mg/(kg·d)，對(duì)照組注射生理鹽水0.5 mL/d，連續(xù)注射5 d，休息2 d 后再注射5 d，繼續(xù)喂養(yǎng)2 d。

1.3 動(dòng)物一般狀況與腫瘤生長情況觀察 給藥期間密切觀察裸鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食情況、活動(dòng)情況。給藥結(jié)束并繼續(xù)喂養(yǎng)2 d后處死裸鼠，連同包膜完整剝離出腫瘤組織。稱取裸鼠體質(zhì)量和瘤體質(zhì)量，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組抑瘤率后-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ至雎?(對(duì)照組平均瘤體質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤體質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤體質(zhì)量×100%。

1.4 腫瘤組織Bax、Caspase-3、p53 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。取腫瘤組織，TRIzol法提取總RNA，測定RNA濃度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成。引物序列：Bax上游5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′,下游5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′；Capase-3上游5′-TGGAATTGATGCGTGATGTT-3′,下游5′-GGCAGGCCTGAATAATGAAA-3′；p53上游5′-CTGCCCTCAACAAGATGTTTTG-3′,下游5′-CTATCTGAGCAGCAGCGCTCATGG-3′；GAPDH上游5′-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3′,下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 腫瘤組織Bax、Caspase-3、p53蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取腫瘤組織，加入蛋白裂解液充分裂解，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白總量。取80 μg蛋白加入上樣緩沖液，煮沸變性5 min，迅速低溫冷卻后加樣，瓊脂糖凝膠電泳。切取含目的蛋白條帶的膠塊轉(zhuǎn)膜處理及TBST沖洗后，加入封閉液，4 ℃孵育過夜。TBST沖洗，加入二抗，室溫孵育 1 h。TBST沖洗，凝膠成像儀曝光并顯色，測定條帶光密度值。以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白光密度的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般狀況與腫瘤生長情況比較 造模成功后，對(duì)照組逐漸出現(xiàn)腹水，進(jìn)水、飲食量及活動(dòng)明顯減少，體質(zhì)量增加；實(shí)驗(yàn)組除用藥30 min內(nèi)精神較差、活動(dòng)明顯較前減少而后逐漸恢復(fù)正常外，飲食量略有減少，進(jìn)水正常。兩組體質(zhì)量、瘤體重量比較見表1。實(shí)驗(yàn)組抑瘤率為51.61%。

表1 兩組體質(zhì)量、瘤體質(zhì)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 兩組腫瘤組織Bax、Caspase-3、p53 mRNA表達(dá)比較 見表2。

表2 兩組Bax、Caspase-3、p53 mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.3 兩組腫瘤組織Bax、Caspase-3、p53蛋白表達(dá)水平比較 見表3。

表3 兩組Bax、Caspase-3、p53蛋白表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

3 討論

結(jié)腸癌容易早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。目前，手術(shù)切除腫瘤根治術(shù)仍是結(jié)腸癌的主要治療方法，但殺滅原位殘留或轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，需要有效的化療藥物。雷替曲塞為新一代的特異性胸苷酸合成酶抑制劑，具有水溶性，為一種喹唑啉葉酸鹽類似物，通過還原后的葉酸載體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)攝取，從而在葉酸基聚谷氨酸合成酶的代謝過程中，迅速代謝為系列多聚谷氨酸類化合物。這些代謝物具有更強(qiáng)抑制胸苷酸合成酶的活性，抑制癌細(xì)胞DNA的合成，從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞內(nèi)保留時(shí)間長更加利于發(fā)揮強(qiáng)力有效的細(xì)胞毒作用[6～9]。目前，雷替曲塞已逐步成為結(jié)直腸癌化療的一線用藥。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞發(fā)生的程序性死亡過程，受多種基因調(diào)控。相關(guān)研究顯示，Caspase蛋白酶是特異切割天冬氨酸位點(diǎn)的蛋白水解酶，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用，其中Caspase-3處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游，可通過滅活凋亡抑制因子、水解激活促凋亡因子Bid、直接降解細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白等途徑引起細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)地凋亡[10]；Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白之一，定位于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)死亡信號(hào)將其激活后，活化的Bax可轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，通過形成同源二聚體而導(dǎo)致線粒體膜通透性增大，釋放促凋亡因子，最終引起細(xì)胞凋亡[11]；p53作為一種凋亡活化基因，其除了能夠通過介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將應(yīng)激信號(hào)傳入細(xì)胞，并作為轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)短暫或長期阻滯細(xì)胞周期分化、DNA復(fù)制與修復(fù)而阻止癌細(xì)胞早期增殖的目的外，還可直接轉(zhuǎn)移定位于線粒體上，通過與Bcl-2或Bcl-xl的結(jié)合促使Bax游離并活化而發(fā)揮促細(xì)胞凋亡的作用[12]。本研究通過建立結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型，觀察雷替曲塞對(duì)腫瘤的抑制作用，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織內(nèi)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及p53表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯升高，且實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量明顯小于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組抑瘤率為51.61%。可見，雷替曲塞可上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及p53表達(dá),有效抑制移植瘤模型鼠體內(nèi)人結(jié)腸癌移植瘤的生長。薛松等[10]研究發(fā)現(xiàn)，雷替曲塞能夠激活促凋亡蛋白Bax、Caspase-3，推測雷替曲塞可能通過Caspase-3依賴的線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌裸鼠移植瘤的生長。洪雷等[13]報(bào)道，雷替曲塞具有明顯抑制胃癌移植瘤生長的作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)p53表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。馬世華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，雷替曲塞可通過激活促凋亡蛋白Bax、Caspase-3，介導(dǎo)Caspase-3凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)與線粒體膜通透性增大，釋放促凋亡因子，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡；雷替曲塞可能通過上調(diào)P53表達(dá)，增加人胃癌細(xì)胞株S期的比例，降低G0/G1期細(xì)胞比例，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制人胃癌細(xì)胞株生長。

綜上所述，雷替曲塞可通過調(diào)節(jié)Bax、Caspase-3和p53蛋白及其RNA的表達(dá)水平激活結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡通道，抑制裸鼠皮下人結(jié)腸癌細(xì)胞移植瘤的生長。