皮下注射尼古丁對大鼠椎間盤退變的影響及其機制

吳磊磊，邱玉金，王學文，趙司順

濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊261000

研究顯示，機械應力、損傷、基因突變、年齡、營養等影響因素均會造成椎間盤退變[1]。椎間盤作為人體最大的無血管組織，營養供應缺乏，其營養主要是通過椎間盤纖維環途經和軟骨終板途徑被動擴散而來[2]，而營養物質的擴散必須借助于水的擴散來完成。水的跨膜轉運方式包括脂質雙分子層的簡單擴散與通道介導的跨膜轉運，前者水擴散緩慢，而后者介導的水轉運速度快，不需要消耗能量，也不受門控機制的影響，這種通道就是水通道蛋白(AQPs)[3]。分布在人類椎間盤上的AQPs主要是AQP1和AQP3，二者共同維持椎間盤的含水量，保證椎間盤的營養。研究發現，尼古丁可引起椎間盤軟骨終板的血管收縮變性，管壁肥厚，管腔狹窄，血流量減少，導致椎間盤營養供應減少，造成椎間盤退變。目前對于尼古丁在椎間盤退變過程中對AQPs的影響鮮有報道。我們對大鼠皮下注射尼古丁，觀察其椎間盤退變程度以及椎間盤組織中AQP1、AQP3蛋白的表達變化，探討尼古丁對椎間盤退變的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 SPF級健康雄性Wistar大鼠30只，8～9周齡，體質量200～300 g，購于濰坊醫學院動物中心。尼古丁購于上海友思生物技術有限公司，純度為98%，加入生理鹽水稀釋為2 mg/mL的溶液，冷凍保存，注射前1 h室溫解凍。AQP1多克隆抗體、AQP3多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、枸櫞酸鹽緩沖液、抗體稀釋液均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組與給藥方法 將大鼠隨機分為實驗1組、實驗2組及對照組各10只。實驗1組和實驗2組腹部皮下注射尼古丁稀釋液1.5 mL/(kg·d)，對照組皮下注射等量生理鹽水，連續5周。

1.3 標本采集 實驗1組和對照組于注射5周后、實驗2組于注射10周后，腹腔注射10%水合氯醛處死。將大鼠置于動物手術臺上俯臥位固定，背部正中切口，顯露L4/L5椎體，取出第4、5腰椎，蒸餾水洗凈，用小尖刀及眼科剪仔細剝離L4/L5椎間盤組織。常規石蠟包埋，橫向切片。

1.4 椎間盤退變程度觀察 采用HE染色法。取石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色。加入1%鹽酸乙醇中分化10 s，自來水沖洗，1%酸性伊紅染液染色1 min。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。按照文獻[4]方法對椎間盤退變程度進行分級。1級：纖維環中纖維輕微扭曲，可以見到纖維環輕度撕裂；2級：纖維環中纖維中度扭曲，可以見到纖維環撕裂；3級：纖維環中纖維重度扭曲，可以見到纖維輕微反折畸形；4級：纖維環中纖維嚴重的反向折疊輪廓，椎間盤纖維環撕裂；5級：椎間盤纖維環撕裂，纖維環輪廓模糊不清。

1.5 椎間盤組織AQP1、AQP3表達檢測 采用SABC免疫組織化學染色法。取石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。加入0.3% H2O2消除內源性酶活性，熱抗原修復。滴加5% BSA封閉液(山羊血清封閉液)，室溫下反應25 min；滴加一抗(AQP1、AQP3稀釋濃度均為1∶200)，4 ℃過夜，PBS沖洗。滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育25 min，PBS沖洗。滴加試劑SABC，37 ℃孵育25 min，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素輕度復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以細胞質呈棕黃或棕褐染色為陽性。應用IpWin51C圖像分析系統測定陽性表達的光密度值，每個椎間盤隨機選取2張切片，每張切片隨機選取5個視野，取其平均值。

2 結果

2.1 各組椎間盤退變程度比較 對照組椎間盤各組織結構清楚，纖維環的纖維排列致密、層次分明，纖維環與髓核界限清晰、連接緊密。實驗1組椎間盤各組織結構模糊紊亂，嚴重炎性水腫、黏液樣變性，纖維環的纖維出現撕裂、重度扭曲、反向折疊現象，局部模糊不清，纖維環與髓核連接處出現斷裂，60%為4級退變、35%為3級退變、5%為5級退變。實驗2組椎間盤各組織結構模糊紊亂，層次不清，椎間盤纖維環有不同程度基質填充，但走形仍較紊亂、扭曲。

2.2 各組髓核組織AQP1、AQP3表達水平比較 見表1。

表1 各組AQP1、AQP3表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與實驗1組比較，△P<0.05。

3 討論

研究發現，吸煙可造成椎間盤退變[5]，降低脊柱疾病的治療效果。Iwahashi等[6]報道，尼古丁會造成椎間盤軟骨終板的血管芽變窄，管壁肥厚，管腔狹窄，微血管數量也明顯減少，使得局部血流量減少，氧分壓及氧飽和度明顯下降；Nasto等[5]發現吸煙抑制細胞DNA、蛋白多糖和膠原的合成，促進炎癥介質的合成和釋放，加速細胞凋亡。這會嚴重干擾椎間盤營養的各個環節，造成椎間盤退變。Elmasry等[7]報道，吸煙會使椎間盤的營養血管收縮變性，椎間盤營養供應減少，進而黏多糖等成分合成減少，椎間盤發生退變。

髓核含水量下降是椎間盤退變的主要特征之一[8]，水分的丟失會影響椎間盤的營養，進而促進椎間盤的退變。AQPs作為髓核細胞水分子跨膜轉運的重要通道，在椎間盤髓核含水量的變化中具有至關重要的作用。Richardson等[9]報道，在健康人的椎間盤組織中，AQP1、AQP3在髓核和內層纖維環中均有表達，外層纖維環中僅有少量AQP3表達，而椎間盤各結構均未見AQP2表達。李健等[10]報道，人正常椎間盤的軟骨終板和髓核中均有AQP3表達，纖維環中無表達。表明人椎間盤中的水通道蛋白以AQP1與AQP3表達為主。本研究結果顯示，AQP1與AQP3在大鼠髓核及內層纖維環中明顯表達。

本研究結果顯示，正常對照組與實驗1組中，AQP1與AQP3在椎間盤內均有表達，但是在實驗1組中的髓核與內層纖維環中AQP1、AQP3表達較正常對照組明顯減少。其原因可能與尼古丁引起炎性因子表達上調有關。尼古丁可以刺激內皮細胞表達細胞間黏附分子-1(ICAM-1)[11]以及單核細胞分泌TNF-α[12]，這些炎性因子在椎間盤退變過程中起重要作用。曹國永等[13]對大鼠椎間盤軟骨終板細胞進行體外培養，發現加入尼古丁后細胞中AQP1、AQP3表達減少，并具有濃度依賴性，認為尼古丁對AQPs的表達具有明顯的抑制作用。

AQP1、AQP3是椎間盤水轉運的重要通道，AQP1、AQP3表達下降則椎間盤的水轉運障礙，進出水分減少，伴隨著水轉運而進出細胞的營養物質轉運也會出現障礙，而營養物質的供應減少會造成細胞的功能障礙甚至凋亡；其次，水轉運功能障礙還會導致椎間盤內代謝廢物的積聚，無法盡快運出細胞，損傷椎間盤細胞，造成椎間盤退變。此外，AQP1、AQP3表達減少還會造成對氧[14]、甘油[15]的攝取障礙，更進一步造成椎間盤的營養障礙。而椎間盤退變發生后，含水量減少，營養物質進出細胞受阻，椎間盤細胞的功能受到影響，AQP1、AQP3表達進一步減少，從而形成惡性循環。

為了觀察去除尼古丁刺激后椎間盤的自我修復情況，本實驗對大鼠模型在尼古丁稀釋液皮下注射5周后休養5周;結果顯示，椎間盤組織中AQP1、AQP3表達較尼古丁注射5周時有所增多，但與正常對照組比較差距仍十分明顯。說明去除尼古丁的損傷刺激后，椎間盤營養及代謝的受抑制狀態逐漸解除，椎間盤細胞的功能有所恢復，AQPs合成明顯增多。但這種自主修復并不能完全逆轉椎間盤退變，而且這種修復是相當緩慢的。

綜上所述，尼古丁持續攝入會造成大鼠健康椎間盤的退變加速；AQP1、AQP3在椎間盤退變過程中具有重要作用，其表達減少或活性降低有可能是椎間盤退變的始動因素之一。