“下一代”CAR T細胞在實體瘤治療中的研究進展①

田永貴 張 毅 (鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心，鄭州 450052)

以嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)T細胞為代表的細胞免疫治療手段在腫瘤治療中已經取得革命性的進展。CAR T細胞是經過基因改造以表達CAR的自體或異體T細胞。CAR是融合蛋白，包含識別抗原的單鏈可變區(single chain fragment variable,scFv)、跨膜區和胞內信號區(共刺激信號和CD3ζ)。與TCR不同，CAR以非MHC限制的方式特異性識別腫瘤細胞上的抗原[1]。CAR T細胞歷經四代，已取得了顯著性的進展。第一代CAR僅包含一個胞內信號傳導域CD3ζ。第二代和第三代CAR是在第一代CAR的基礎上分別加入一個或兩個共刺激信號域(例如CD28、OX40和4-1BB)來構建[2]。第四代CAR則是進一步引入功能性細胞因子來增強T細胞的殺傷和擴增能力。

2017年，CD19 CAR T細胞獲得了美國FDA批準用于白血病和淋巴瘤的治療。至此，CAR T細胞已經在B細胞惡性腫瘤中發揮了顯著療效，徹底改變了腫瘤免疫治療領域。然而，由于實體瘤的免疫抑制性微環境和抗原異質性，CAR T細胞在實體瘤的治療中效果欠佳[3]。Lim和June[4]總結了CAR T細胞治療的五個主要挑戰，包括腫瘤抗原的異質性、CAR T細胞浸潤不足、增殖和持久性差、毒性控制以及免疫抑制性的微環境。這些問題都急需“下一代”CAR 的結構改造來進一步提高實體瘤的治療效果。基因工程技術的發展為CAR T細胞的改造提供了多種途徑，通過靶向多種抗原、過表達細胞因子或者趨化因子受體、增強共刺激信號和消除抑制因子等以達到增強CAR T細胞功效的目的(圖1)。目前，這些“下一代”CAR T細胞已在臨床前模型中顯示出令人鼓舞的結果，在實體瘤的治療中發揮潛力。

1 提高CAR T細胞的抗原識別能力

CAR T細胞通過識別特異性抗原來靶向腫瘤，抗原的識別是CAR T細胞發揮療效的前提。為了避免免疫逃逸，并提高安全性，選擇在腫瘤組織中特異性高表達的腫瘤相關抗原作為CAR T細胞的靶點[5,6]。腫瘤相關抗原分為5個類型：分化抗原、過表達抗原、癌睪抗原(黑色素瘤抗原，MAGE家族)、病毒抗原(HPV、EBV、HBV等)和腫瘤新生抗原(突變抗原)。與血液腫瘤相比，實體瘤存在抗原異質性表達的特點。CAR T細胞優先殺傷高表達靶向抗原的腫瘤細胞，但是可能無法消除較低抗原密度的細胞[7]。多種研究數據表明，CAR T細胞的治療會導致靶向抗原的下調，這是導致腫瘤復發的原因之一[8]。

圖1 基因工程改造“下一代”CAR T細胞的方法Fig.1 Genetically engineered strategies for "Next Generation" CAR T cellsNote:"Next Generation" CAR T cells enhance potent antitumor properties by gene-editing technology.Multi-target CAR T cells improve antigen recognition and reduce immune escape.CAR T cells equipped with chemokine receptors overcome their poor trafficking to tumor sites.Optimizing costimulatory signals and overexpressing cytokines enhance CAR T cell proliferation and persistence.In addition,manipulating negative regulators in CAR T cells helps to regain the effector response.

研究證實，靶向單個抗原的CAR T細胞造成抗原陰性細胞的生長，為了解決這種問題，研究者開發了靶向兩種或者多種不同腫瘤相關抗原的CAR T細胞，以提高其對抗原的識別能力，增加療效和安全性，降低腫瘤逃逸的風險[3]。Hegde等[9]設計了一種雙靶點CAR T細胞，他們將HER2抗體的單鏈可變區(scFv)與IL-13Rα2結合的IL-13突變蛋白連接在一起，形成串聯型CAR(TanCAR)胞外域，這種雙特異性TanCAR T細胞共同識別HER2和IL13Rα2。同單靶點CAR T細胞相比，TanCAR T細胞顯示出更好的活化能力，且持久性增加。在膠質母細胞瘤小鼠模型中，TanCAR T細胞抗腫瘤活性功能較強，降低抗原逃逸的發生概率，從而顯著延長了小鼠的生存期[9]。采用類似的方法，Bielamowicz等[10]構建了靶向HER2、IL13Rα2和 EphA2三種抗原的三靶點CAR T(Trivalent CAR T)細胞。這種三靶點CAR T細胞比雙靶點細胞更有效，克服了膠質母細胞瘤的抗原異質性所導致的免疫逃逸并改善了治療效果。同時靶向CD19和CD22的CAR T細胞治療復發和難治性B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)患者，使其達到長期緩解的狀態[11]。除CD22外，正在研究的共同靶點還有CD20、CD123和CD133[12-14]。此外，上調腫瘤相關抗原的表達同樣可以提高CAR T細胞的識別能力。Mei等[15]研究發現外源添加IL-22可以增加靶點MUC1的表達，因此，構建了表達IL-22的MUC1 CAR T細胞，這種改造的CAR T細胞對MUC1+頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)細胞的識別能力增強，且能更有效地控制腫瘤生長。

Bielamowicz等研究結果顯示，與單靶點和雙靶點CAR T細胞相比，三靶點CAR T細胞表現出更高的細胞毒性和更強的細胞因子釋放能力[9,10]。同時，多種靶點的結合增加了CAR T細胞的潛在脫靶效應。因此，多靶點CAR T細胞的結構設計及其安全性仍需進一步研究。

2 增加CAR T細胞在腫瘤部位的浸潤

CAR T細胞必須遷移至腫瘤部位才能有效控制腫瘤的生長。在血液腫瘤中，CAR T細胞在血液中即可殺傷腫瘤細胞。但是在實體瘤中，腫瘤微環境的低氧、纖維化、豐富的血管和細胞外基質等多種特點，造成CAR T細胞無法有效歸巢至腫瘤部位，這是實體瘤中CAR T細胞療效欠佳的一個重要因素[16]。腫瘤微環境中淋巴細胞浸潤的增加與各種腫瘤的良好預后密切相關[17]。目前，大量的研究致力于將低或無免疫原性的“冷腫瘤”轉變為有免疫原性的“熱腫瘤”[18]。

趨化因子與其受體的相互作用可以促進T細胞的遷移。CAR T細胞中過表達趨化因子受體，可以增加其向高表達同源配體的腫瘤部位遷移。Jin等[19]構建了表達IL-8受體CXCR1或者CXCR2的CAR T(8R70CAR T)細胞。在膠質母細胞瘤，卵巢癌和胰腺癌的臨床前模型中，8R70CAR T細胞顯著增強了腫瘤中T細胞的浸潤和持久性，誘導了腫瘤的完全消退。Craddock等[20]和Moon等[21]分別在神經母細胞瘤和惡性胸膜間皮瘤中研究過表達CCR2(CCL2的受體)的CAR T(CCR2-CAR T)細胞的功能，結果顯示CCR2-CAR T細胞的歸巢能力和抗腫瘤活性均顯著增強。此外，在霍奇金腫瘤中過表達CCR4的CD30-CAR T細胞增強了其對分泌CCL17和CCL22(CCR4的配體)的Reed-Stemberg細胞的歸巢[22]。最近，Adachi等[23]構建了7×19 CAR T(同時表達IL-7和CCL19的CAR T細胞)，這種表達趨化因子的CAR T細胞招募宿主體內的DC和T細胞遷移至腫瘤部位，顯著增強了抗腫瘤功效。

確定合適的趨化因子-趨化因子受體軸是至關重要的，這需要大量工作來尋找腫瘤中高表達的特定趨化因子，并在CAR T細胞上過表達相應的受體。表達趨化因子受體的CAR T細胞可以增加其在腫瘤部位的浸潤，但是趨化因子的非特異性可能將T細胞募至其他位點，產生新的毒性。因此，未來需要從安全性的角度來研究這類CAR T細胞的改造以規避這種風險。

3 提高CAR T細胞的增殖和持久性

T細胞的增殖和持久性是CAR T細胞臨床療效的關鍵預測指標。CAR T細胞在歸巢至腫瘤部位后，必須要經歷擴增達到相對于腫瘤負荷的適當數量，才能在體內消除腫瘤。大量的CAR T細胞療法的臨床試驗報道了體內回輸T細胞的持久性較差，特別是在實體瘤中[5]，如何確保體內CAR T 細胞的擴增數量并持續更長時間來殺傷腫瘤細胞，是當前CAR T細胞研究的重點。

3.1共刺激信號的加入及優化 CAR的結構可以影響T細胞的增殖和持久性。第一代CAR T細胞在腫瘤患者體內的持久性不佳，第二代CAR T細胞的CAR結構增加了一個共刺激域，大大增強了T細胞的持久性和抗腫瘤作用[24]。作為CAR結構中廣泛應用的兩個共刺激域，CD28和4-1BB對T細胞有不同的影響。當以CD28為共刺激分子時，CAR T細胞顯示出更高的初始抗腫瘤能力，糖酵解和細胞因子的產生增加，而以4-1BB為共刺激分子的CAR T細胞顯著增加記憶性T細胞的擴增，氧化磷酸化代謝增加，持久性更高[25,26]。除了已知的共刺激分子以外，其他共刺激信號的加入同樣可以增加CAR T細胞的增殖和持久性。Lai等[27]將TLR2信號引入CAR T細胞，TLR2信號增強了CAR T細胞的增殖，并降低共刺激信號的激活閾值。NKG2D是T細胞的共刺激受體，其信號轉導依賴于DNAX激活蛋白10(DAP10)。Zhao等[28]將DAP10的胞內域引入到第二代CAR M28z中，生成了靶向間皮素的M28z10 T細胞。DAP10的加入促進細胞因子的產生和記憶性T細胞的形成，CAR T細胞的持久性增加。

3.2增加T細胞活化的第3信號的表達 CAR T細胞的活化和增殖不僅需要CD3ζ和共刺激域(信號1和2)，還需要細胞因子的刺激(信號3)，而在腫瘤微環境中這些細胞因子表達能力下調。因此，可以構建細胞因子過表達的CAR T細胞以提供信號3促進CAR T細胞的活化和增殖。多種研究表明，過表達IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21可以促進CAR T細胞的活性[23，29-32]。然而，這些細胞因子的表達可能會導致毒性的增加。為了解決這一問題，Shum等[33]構建了一個表達IL-7細胞因子受體(C7R)的CAR T細胞，C7R是一個組成型信號傳導的受體，不需要外源細胞因子的參與，即可激活下游的STAT5。共表達C7R的CAR T細胞增加了T細胞增殖和存活，增強了抗腫瘤活性。JAK/STAT信號激活由γc家族細胞因子(如IL-7、IL-15和IL-21)介導，因此，Kagoya等[34]開發了一種新型的CAR構建體，將被截短的IL-2Rβ胞內結構域和結合STAT3的YXXQ基序整合到共同刺激域中，稱為28-IL2RB-z(YXXQ)CAR，這種CAR T細胞在抗原結合后激活JAK/STAT信號傳導，表現出優異的增殖能力，促進記憶性T細胞的分化和維持。

4 克服CAR T細胞的功能障礙

在實體瘤中，CAR T細胞歸巢至腫瘤部位不足以達到預期的臨床療效。腫瘤的免疫抑制性微環境和T細胞的內在因素導致CAR T細胞的效應功能逐步喪失，功能障礙的CAR T細胞無法殺傷腫瘤細胞[35]。T細胞的功能受多種因素的調節，例如免疫檢查點分子，抑制性細胞因子，轉錄因子，代謝分子和凋亡基因等[36]。目前，越來越多的研究集中在調節這些因素以克服CAR T細胞的功能障礙(T細胞無能、耗竭、衰老和凋亡)，增強CAR T細胞的功效。

4.1免疫檢查點分子 CAR T細胞受到腫瘤微環境中抑制性免疫檢查點信號的干擾，例如PD-1、CTLA-4、LAG3，這些信號的表達抑制了T細胞的殺傷功能，最終導致免疫逃逸。為了解決這種現象，多種強大的基因編輯技術(CRISPR/Cas9、TALEN和AAV-Cpf1)被用于敲除免疫檢查點分子以逆轉CAR T細胞的耗竭表型，改善其抗腫瘤功能[37-40]。大量研究表明，PD-1的敲除增加了CAR T細胞浸潤和持久性，增強了腫瘤清除率，并預防復發[38,41-45]。類似地，LAG3或CTLA-4的缺失同樣可以改善CAR T細胞功能[39,40]。最近，Ren等[46]設計了一種可以進行多基因編輯的快速有效的CRISPR系統(one-shot CRISPR protocol)，可同時敲除HLA-Ⅰ、TCR、PD-1和CTLA-4四種基因，以產生PD-1和CTLA-4同時缺失的通用型CAR T細胞，這可能會增強CAR T細胞的功能。但是，gRNA競爭以及慢病毒的包裝尺寸的限制導致CAR T細胞的轉染效率大大降低。

除了敲除免疫檢查點，顯性負受體(dominant negative receptor,DNR)和嵌合開關受體(chimeric switch receptor,CSR)也是克服腫瘤免疫抑制的途徑。PD-1 DNR敲除了PD-1的跨膜區和胞內域，只保留胞外結合域。這種改造增強了CAR T細胞分泌細胞因子的能力和細胞毒性，顯示出了更有效的腫瘤控制能力[47]。CSR將免疫檢查點分子的胞內信號域轉換為胞內共刺激域，逆轉CAR T細胞中免疫檢查點的抑制作用，將抑制信號轉化為激活信號。研究證實，具有PD-1/CD28的CAR T細胞其耐受性更強，且顯著提高抗腫瘤活性[48]。CTLA-4/CD28改造的T細胞也發揮了類似的作用[49]。

4.2抑制性細胞因子 腫瘤微環境還富含免疫抑制性細胞因子。TGF-β有抑制免疫細胞的功能，為腫瘤的生長和轉移提供有利的微環境。為了消除TGF-β對CAR T細胞的抑制作用，Kloss等[50]和Zhang等[51]設計了TGF-βⅡ型的顯性負受體(dnTGF-βRⅡ)，CAR T細胞表達dnTGF-βRⅡ后，在小鼠模型中觀察到這些CAR T細胞的增殖增加，細胞因子分泌和體內持久性增強，延長了小鼠的生存期。IL-4在多種實體瘤中表達水平升高，在促進腫瘤進展中起關鍵作用。研究者構建了IL-4受體的CSR，將IL-4受體的胞內域轉化為IL-7受體胞內域(4/7 ICR)或IL-21受體胞內域(4/21 ICR)。當IL-4刺激及抗原識別后，4/7 ICR或4/21 ICR改造的CAR T細胞表現出強的裂解能力和增殖潛能[52,53]。

4.3轉錄因子 轉錄因子在T細胞功能調節中發揮重要的作用。核受體轉錄因子NR4A家族包括NR4A1、NR4A2和NR4A3。腫瘤微環境中T細胞PD-1和TIM3的表達與NR4A受體的激活相關[54]。Chen等[55]將CAR T細胞中的3個NR4A同時敲除，NR4A缺失的CAR T細胞顯示PD-1和TIM3表達水平的下調，并延長了荷瘤小鼠的生存期。最近，研究表明編碼高遷移率族框蛋白的轉錄因子TOX是T細胞衰竭的關鍵轉錄調節因子。Seo等[56]發現TOX和TOX2在耗竭表型的CAR T細胞中高表達。TOX和TOX2雙重敲除的CAR T細胞抑制性受體表達減少，細胞因子產生增加，顯示出了優于TOX-/-或TOX2-/-CAR T細胞的抗腫瘤能力。

4.4其他分子 CAR T細胞代謝分子及凋亡基因的改造為克服T細胞的功能障礙提供了另一種策略。二酰基甘油激酶(DGK)是一類分解二酰基甘油(DAG)的酶，有三種同工型，分別是DGKα、DGKδ和DGKζ。DGK的激活可導致TCR下游分子的下調，可能成為腫瘤治療的潛在靶標[57]。Jung等[58]使用CRISPR/Cas9介導CAR T細胞中DGKα和DGKζ的雙敲除(DGK dKO CAR T)，DGK的缺失增加了TCR信號傳導，增強CAR T細胞效應功能，并顯著誘導膠質母細胞瘤的消退。Fas受體通過與配體(FasL)結合而誘導凋亡。Ren等[46]對CAR T細胞進行了TCR、HLA-Ⅰ和Fas的三重基因敲除。Fas消融的CAR T細胞具有抗凋亡作用，并增強了CAR T細胞的腫瘤控制能力。

5 挑戰與展望

CD19 CAR T細胞在B細胞淋巴瘤的患者治療中顯示出空前的臨床成功，這證明了CAR T細胞在抗腫瘤治療中的巨大潛力。相比之下，CAR T細胞治療實體瘤的臨床療效卻不盡人意。腫瘤微環境和T細胞的內在因素是導致CAR T細胞療效欠佳的主要原因。研究者運用基因工程技術改造CAR T細胞以突破這些障礙增加CAR T細胞功能。靶向多種腫瘤相關抗原提高CAR T細胞的識別能力，減少免疫逃逸。過表達趨化因子受體或趨化因子的CAR T細胞增加了免疫細胞在腫瘤部位的聚集，是CAR T細胞殺傷腫瘤的前提。共刺激信號或T細胞活化信號3的增加(細胞因子，細胞因子受體或其下游途徑的基因表達)實現了CAR T細胞的最佳激活，增殖和持久性。敲除或者逆轉T細胞抑制性因子來克服CAR T細胞的功能障礙，增強抗腫瘤能力。這些改造的CAR T細胞表現出了優于常規CAR T細胞的抗腫瘤能力。迄今為止，對CAR T細胞的研究更多地集中在增強其功能上，但是，在幾乎所有的臨床試驗中，都有不良反應(例如細胞因子釋放綜合征和神經毒性)，有些可能是致命的。隨著CAR T細胞的改造，不良反應可能會增加，因此，CAR T細胞的毒性控制是一個不可忽略的問題。此外，目前各種改造策略均表現出控制腫瘤生長的能力，哪種策略或者改造組合是最有效的，仍然需要大量的臨床前模型去檢測。盡管如此，“下一代” CAR T細胞顯示的優越的抗腫瘤能力仍然給腫瘤患者帶來了曙光，為我們之后的研究指引了方向。