基于腫瘤微環境的CAR-T細胞療法研究現狀①

武少賢 蔣敬庭 (蘇州大學附屬第三醫院腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術研究中心，蘇州大學細胞治療研究院,常州 213003)

嵌合型抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)是經過基因工程改造的T細胞，可以激活對腫瘤特異性抗原的免疫應答。腫瘤通過破壞TCR活性來逃避腫瘤殺傷，但CAR采用了一種靶向方法，從而“避免了逃避機制”，使腫瘤再次易受T細胞介導的攻擊。CAR-T細胞療法在血液系統腫瘤治療方面已顯示出顯著效果。特別是在急性淋巴細胞白血病(ALL)中有較高的抗腫瘤效應[1]。然而，CAR-T細胞療法在實體腫瘤中療效欠佳。在腫瘤進展過程中，腫瘤細胞會改變正常的發育過程，形成抑制性的腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)，其中包括免疫細胞、成纖維細胞和內皮細胞以及多種抑制分子[2]。從最早的浸潤前病變形成到轉移擴散，TME可以支持血管生成、腫瘤進展和免疫逃逸，并決定對腫瘤治療的反應。盡管實體腫瘤中的腫瘤反應性T淋巴細胞面臨各種各樣的困難，但越來越多的證據表明，對癌癥患者的自體免疫系統進行誘導和工程改造可以顯著改變臨床療效，特別是在黑色素瘤、胰腺癌等惡性腫瘤中[3]。對TME復雜成分與免疫功能之間關系的研究將為CAR-T細胞療法攻克實體腫瘤提供新的依據。

1 CAR-T細胞的結構及優化設計

CAR由胞外、跨膜和胞內結構域組成。胞外結構域由衍生自抗體輕鏈和重鏈區的單鏈可變片段(scFv)組成，不需MHC分子參與即可與特定的腫瘤相關抗原(TAA)結合。跨膜間隔子也稱為鉸鏈結構域，由CD8和IgG4分子組成，起到連接胞內和胞外的作用。細胞內結構域也稱為激活或信號結構域，由CD3ζ組成。基于細胞內信號傳導域，CAR受體具有4代。CD3ζ在第一代中只是細胞內結構域，產生的治療反應有限[4]。為增強T細胞的活化、增殖和持久性，添加了其他共刺激分子，如CD27、CD28、4-1BB或OX-40。第二代由一個共刺激分子組成，第三代由兩個共刺激分子組成。除了CD3ζ和共刺激分子外，第四代還增加了抗腫瘤細胞因子基因(IL-12、IL-15)，從而增強了CAR-T細胞的抗腫瘤作用[5,6]。

目前，CAR-T的臨床研究主要集中在以CD19為靶點的血液系統腫瘤中，包括非霍奇金淋巴瘤以及急性B淋巴細胞白血病(B-cell acute lymphocytic leukemia,B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)[7]。CD19靶抗原僅在B細胞上表達，因此為CAR-T細胞治療提供了良好的靶點。然而，實體瘤缺乏合適的腫瘤相關抗原且具有異質性，即常用的靶標通常在腫瘤細胞上過表達，但在非惡性組織上也低表達，這意味著正常組織也可能受到攻擊。目前，已經開發三類雙特異性CAR來解決此類問題，即雙重CAR[8]、串聯CAR(Tan CAR)[9]和抑制性CAR(iCAR)[10]，當腫瘤細胞表面同時存在兩種靶抗原時，該類型CAR-T細胞才能被激活，顯著增強特異性，從而使旁觀者細胞不受影響。如Feng等[11]在晚期膽管癌患者中連續輸注抗EGFR和抗CD133 CAR-T細胞，導致抗腫瘤功效增強。此外，Roybal等[12]利用syn Notch(synthetic Notch)對雙重CAR進行了升級，該類型CAR與第一種抗原結合，然后通過合成的Notch受體響應于指定抗原的識別而誘導轉錄激活，可以調節CAR-T細胞的活性。最近，Cho等[13]開發了一種分離、通用、可編程式(split,universal and programmable,SUPRA)CAR，將T細胞與抗體分離，增強了T細胞轉換追蹤目標的能力，該種CAR必須同時識別腫瘤細胞上的兩個靶點才能激活，降低了CAR-T帶來的毒副作用。

2 腫瘤微環境對CAR-T治療的影響

2.1血管障礙 從最早的浸潤前病變形成到轉移擴散，TME可以支持血管生成，血管生成是腫瘤生長和轉移的重要標志[14]。脈管系統與正常血管相比具有異常的結構和功能特性，異常脈管系統的形成導致支持腫瘤生長的低氧和酸性環境的產生。血管生成需要癌癥相關的成纖維細胞(CAF)和多種生長因子的調控，如血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(TGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)等。VEGF在內皮細胞中表達，低氧和酸性環境有助于血管生成，被認為是惡性腫瘤的主要血管生成因子[15]。這些血管屏障導致CAR-T細胞很難進入腫瘤內部。

2.2基質障礙 TME的基質屏障由結締組織形成，對免疫系統重塑以及腫瘤的生物學行為具有重要影響。胞外基質(ECM)包含多種成分，包括膠原蛋白、蛋白聚糖、纖連蛋白、層黏連蛋白等。在實體瘤中，膠原蛋白和纖連蛋白提供細胞結構支撐，而蛋白聚糖則有助于生長因子和細胞因子結合特性[16]。然而有研究報道ECM中的非結構性基質蛋白，如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，能夠促進腫瘤細胞的增殖與遷移[17]。因此需要增加CAR-T細胞降解富含基質的ECM的能力。

2.3免疫抑制細胞及其分泌的細胞因子 調節性T細胞(Tregs)通過其抑制功能來防止由于過度或不必要的免疫激活而導致的自身免疫和組織損傷，在維持自我耐受和免疫穩態中具有重要作用[18]。然而，在腫瘤微環境中，Treg細胞通過其高親和力IL-2受體從周圍攝取IL-2，使其無法用于反應性T細胞。它們還組成性表達細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)，下調抗原呈遞細胞(APC)的CD80/CD86表達，從而抑制反應性T細胞的活化。Treg細胞還產生免疫抑制性細胞因子，例如IL-10，也可下調APC功能。這種IL-2/IL-2受體依賴性和CTLA-4依賴性機制是Treg介導的包括腫瘤在內的各種組織抑制作用的核心基礎[19]。

骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)起源于骨髓生成過程中骨髓(也包括小鼠脾臟)的普通髓樣祖細胞(CMP)。MDSC有兩種亞型：單核(M-MDSC)和多形核或粒細胞MDSC(PMN-MDSC)。MDSC由骨髓經血液循環，流向炎癥部位和實體瘤。在TME的炎性環境中，多種因素促進MDSC抑制活性[20]。在外周淋巴器官中，PMN-MDSC會保留大量的各種活性氧(ROS)，并會導致抗原特異性T細胞抑制/耐受。M-MDSC產生大量不同的因子，可使自身細胞抑制抗原特異性和非特異性T細胞應答，M-MDSC維持STAT3的高活性，阻止了他們向樹突狀細胞(DC)或巨噬細胞的快速分化。

在TME中由于缺氧的影響，MDSC中的STAT3活性大大降低。這導致M-MDSC快速分化為腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages,TAM)。PMN-MDSC中的ROS水平顯著降低，但精氨酸酶1(ARG1)的上調和其他引起非特異性T細胞抑制的因素增加。M-MDSC也會發生同樣的情況。同時垂死的MDSC細胞釋放的因子可以促進免疫抑制機制[21]。自然殺傷(NK)細胞是從骨髓中常見的淋巴祖細胞發育而來的固有淋巴細胞，是抵抗外來病原體感染和清除惡變細胞的第一道防線。然而Bruno等[22]指出NK細胞在子宮脈管系統中具有重要的促血管生成作用，NK細胞介導的腫瘤免疫監視所需的Stat5基因失活會上調NK細胞中的VEGFA并增強小鼠淋巴瘤模型中的血管生成[23]。

巨噬細胞被募集到與TME的基質中，朝著與癌癥進展有關的M2巨噬細胞極化。TAM通過產生生長因子(如EGF、VEGF)來維持腫瘤的生長，通過釋放蛋白酶(例如組織蛋白酶、MMP-2、MMP-9)和可溶性介質(例如TGF-β、IL-37)來促進胞外基質的重塑。通過釋放MMP-9或其他可溶性因子(例如VEGF、PDGF、胸苷磷酸化酶、CXCL8)促進血管生成和淋巴管生成，并通過釋放可溶性介質(如IL-10、IDO、TGF-β)抑制抗腫瘤免疫應答[24]。除此之外，腫瘤相關的中性粒細胞(tumor associated neutrophils,TAN)在腫瘤的生長和進展中也展現出雙重作用，TAN可以通過釋放ROS和中性粒細胞彈性蛋白酶來介導腫瘤細胞殺傷，通過釋放ROS抑制腫瘤細胞轉移，并在抑制TGF-β后增強抗腫瘤T細胞反應。相反，TAN可通過釋放ROS促進遺傳不穩定，通過彈性蛋白酶促進腫瘤細胞增殖，通過釋放VEGF、MMP-9或Bv8維持血管生成，通過可溶性介質增強腫瘤細胞的侵襲性，通過表達由TGF-β驅動的精氨酸酶，有效地抑制抗腫瘤CD8+T細胞免疫反應[24]。

2.4免疫抑制性分子 TME可以促進免疫抑制受體在T細胞上的表達，如淋巴細胞激活蛋白3(LAG-3)、T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白分子3(TIM-3)、CTLA-4、程序性死亡受體1(PD-1)等。CTLA-4主要在輔助T細胞和Treg細胞上表達，是CD28的同源物。當CTLA-4與APC上的配體B7分子結合后導致T細胞活化受到抑制。因此，CTLA-4阻斷可以放大針對腫瘤的T細胞反應[25]。PD-1是另一個關鍵的免疫檢查點受體，作為T細胞功能的負調節劑，其表達比CTLA-4廣泛。TME中活化的CD8+T細胞和Treg以及非淋巴細胞均可誘導PD-1的表達。其作用機制是和腫瘤細胞表面的PD-L1結合后抑制T細胞的活化和增殖，促進腫瘤發生免疫逃逸[26]。因此，PD-1抗體和CTLA-4抗體的聯合使用成為抗腫瘤的有效治療方法[27,28]。目前針對這些檢查點開展了一系列臨床試驗[29]。除此之外，TME中氧氣和營養供應不足，缺氧誘導因子1(HIF1)誘導各種促血管生成基因的表達。并且在低氧條件下，腫瘤細胞消耗葡萄糖并分泌乳酸，產生酸性腫瘤微環境[15]。同時，腫瘤也會分泌一些趨化因子，如CXCL12和CXCL15，不利于T細胞浸潤到腫瘤部位[30](圖1)。

3 實體瘤腫瘤微環境的CAR-T細胞治療策略

3.1增強CAR-T細胞向實體瘤部位的運輸 CAR-T細胞治療在實體瘤中效果不佳的一個因素就是其向腫瘤部位運輸的低效率。在血液腫瘤中，輸注CAR-T細胞之后可以直接殺傷在血液中的腫瘤細胞。因此Brown等[31]采用局部遞送的方法將CAR-T細胞顱內遞送至3例復發性膠質母細胞瘤患者切除腔中，有兩名患者在切除切緣未見腫瘤復發。接著Brown等[32]對一名患有復發性多灶性膠質母細胞瘤的患者通過兩條途徑(鼻腔內和腦室內)遞送靶向與腫瘤相關的抗原白介素13受體α2(IL13Rα2)CAR-T細胞，與腔內相比，腦室內途徑在控制遠期復發方面具有更好的反應。在一項臨床前試驗中Murad等[33]構建了靶向腫瘤相關糖蛋白72(TAG72)的CAR-T細胞，通過向卵巢腫瘤異種移植模型中腹膜內遞送該種CAR-T細胞能夠顯著延緩腫瘤生長，提高了小鼠的整體存活率。在一項Ⅰ期臨床試驗中，Katz等[34]在具有肝轉移的大腸癌中，通過肝動脈局部輸注靶向CEA的CAR-T細胞療法已顯示出顯著效果。

圖1 CAR-T細胞治療與腫瘤微環境Fig.1 CAR-T cell therapy and tumor microenvironmentNote:A.CAR-T cell bind to tumor antigens through CAR receptors to produce antitumor effects;B.The solid tumor tumor microenviron-ment consists of a complex vasculature,matrix barrier,and a variety of immunosupp-ressive cells.At the same time,immuno-suppressive cells and tumor cells secrete various cytokines and chemokines.These factors make it difficult for T cells to infiltrate solid tumor tissues and inhibit the function of T cells.

T細胞會表達各種趨化因子受體來向腫瘤部位遷移，然而腫瘤細胞表達的趨化因子往往與其不匹配，限制了CAR-T細胞向腫瘤部位的運輸。Whilding等[35]在靶向腫瘤相關αvβ6整聯蛋白的CAR-T細胞中共表達了其同源受體(CXCR1或CXCR2)。結果顯示，表達CXCR2的CAR-T細胞顯示出針對已建立的表達αvβ6的卵巢或胰腺腫瘤異種移植物的優異的抗腫瘤活性。在神經母細胞瘤中，利用其產生趨化因子CCL2，設計了針對靶向GD2的CAR-T細胞，通過強制共表達趨化因子受體CCR2b可以增強這種作用，因為該受體指導向CCL2的遷移，并且在小鼠模型中證實該種CAR-T細胞具有較好的歸巢能力及抗腫瘤效應[36]。此外，T細胞區成纖維網狀細胞產生的IL-7和CCL19對于淋巴器官中T細胞區的形成和維持至關重要，因此Adachi等[37]構建了能夠產生IL-7和CCL19的CAR-T細胞，能夠將T細胞和DC募集到腫瘤微環境中，增強了CAR-T細胞的抗腫瘤作用。

3.2中和腫瘤微環境中的免疫抑制介質 當CAR-T細胞進入實體瘤后，會受到各種抑制性分子的影響，通過改造CAR的結構，使其產生能夠重塑TME的分子，增強對實體瘤的抗腫瘤作用。通過將CAR-T細胞與免疫檢查點封鎖抑制劑聯合使用，可增強CAR-T細胞療法對反應不良腫瘤的療效。Rafiq等[38]構建了能夠分泌PD-1阻斷單鏈可變片段(scFv)的CAR-T細胞，起到與CAR-T細胞和檢查點抑制劑聯合治療所達到的效果。這種方法保護CAR-T細胞免受PD-1抑制，從而可以避免與系統檢查點抑制相關的毒性。TGF-β是上皮細胞中重要的調節性腫瘤抑制因子，它在早期抑制增殖并誘導凋亡。然而，腫瘤細胞發展出克服TGF-β誘導的抑制作用的機制。一旦發生這種情況，細胞可能會對這種細胞因子產生反應，從而誘導其他有助于腫瘤進展的作用[39]。Zhang等[40]在前列腺癌中構建了前列腺特異性膜抗原(PSMA)特異和對免疫抑制劑分子TGF-β不敏感的CAR-T細胞，可抵抗TGF-β介導的細胞毒性T細胞功能的抑制。在小鼠異種移植模型中發現輸入該種CAR-T細胞的小鼠腫瘤得到顯著抑制，并且小鼠的血清IFN-γ和IL-2水平升高，表明其激活了機體抗腫瘤免疫力。

除此之外，還可以利用CAR-T細胞作為生產媒介物將促炎細胞因子(比如IL-12、IL-15、IL-18)分泌到腫瘤組織中，增強T細胞的效應能力。Hu等[41]構建了兩種分泌IL-18的CAR，體外實驗均證實IL-18可以增強靶向CD19和靶向MSLN的CAR-T細胞增殖，增強了靶向CD19的CAR-T細胞小鼠體內抗腫瘤活性。在神經母細胞瘤中，Chen等[42]優化了靶向GD2的CAR-T細胞，使其分泌IL-15，結果顯示產生IL-15的GD2 CAR-T細胞在體外反復暴露于腫瘤細胞后具有增強的細胞毒活性，并產生Th1細胞因子，同時降低CAR-T細胞表面PD-1的表達，在異種神經母細胞瘤小鼠模型中顯著抑制腫瘤生長。同樣在卵巢癌中，Yeku等[43]設計了一種能夠組成性分泌IL-12的靶向Muc16的CAR-T細胞，在腹水微環境中增殖更好，保留細胞毒性并抵抗凋亡。該種CAR-T細胞能夠介導TAM細胞耗竭和抵抗內源性PD-L1誘導的抑制作用。在卵巢腹膜癌的同基因模型中提高了小鼠生存率。這些發現顯示了抑制性微環境的作用以及如何進一步改造CAR-T細胞以維持功效。

表1 針對實體瘤腫瘤微環境開展的CAR-T臨床前和臨床研究

Tab.1 CAR-T preclinical and clinical studies on solid tumor microenvironment

Malignancy typeTarget antigenCAR signalingIdentifierReferenceCholangiocarcinomaEGFR-CD1334-1BB-CD3NCT01869166 NCT02541370[11]GlioblastomaIL13Rα24-1BB-CD3NCT02208362[32]Ovarian cancerTAG724-1BB-CD3[33]Hepatic carcinomaCEACD28-CD3NCT01373047[34]Pancreatic cancerαvβ6CD28-CD3[35]NeuroblastomaGD2CD28-OX-40-CD3[36]Ovarian cancerMuc16CD28-CD3[38]Prostate cancerPSMACD3[40]NeuroblastomaGD2CD28-CD3[42]Malignant pleural mesotheliomaCAFCD28-CD3[44]

3.3增強腫瘤微環境中CAR-T細胞療效的其他方法 癌癥相關的成纖維細胞(CAF)促進血管生成，有助于實體瘤的進展和轉移，因此Schuberth等[44]構建了靶向成纖維細胞活化蛋白(FAP)的CAR-T細胞，在體外以抗原特異性方式裂解FAP陽性間皮瘤細胞和炎性成纖維細胞，并且抑制了FAP陽性人類間皮瘤細胞在小鼠腹膜腔的生長，并顯著延長了小鼠的生存期。此外，T細胞代謝途徑的修飾也為抵消免疫抑制性TME提供另一種思路。T細胞的活化增殖以及發揮效應功能需要糖酵解提供能量，然而腫瘤細胞擴張需要更多的能量，對T細胞的有效活化具有競爭性抑制作用。可以通過在體外培養時限制糖酵解代謝來保留其抗腫瘤活性，如外源精氨酸補充體外培養基抑制T細胞糖酵解代謝，同時促進氧化途徑，導致體內細胞持久性和抗腫瘤活性增加(表1)[45,46]。

4 展望

CAR-T細胞療法在血液系統腫瘤中已經展示了令人滿意的臨床效果，但針對實體瘤的CAR-T細胞療效欠佳。主要原因在于實體瘤具有復雜的免疫抑制微環境，限制了CAR-T細胞的運輸并降低了其活性。近年來，開發新方法來破解實體瘤引起的障礙，并針對這些特定適應癥優化CAR-T細胞治療，包括尋找新的腫瘤特異性抗原和CAR-T在腫瘤部位的浸潤，中和或調節免疫抑制性TME，優化CAR-T功能減輕潛在的毒性等，在一定程度上揭示了CAR-T細胞治療在實體瘤中的作用機理，使實體瘤的治療取得較好療效，也為腫瘤患者帶來福音。