茯苓酸通過上調miR-133a影響子宮肌瘤細胞增殖凋亡及表皮生長因子的水平

王 佳 梁葵香 劉艷妮 楊延冬 (濱州醫學院附屬醫院婦產科，濱州 256603)

子宮肌瘤是育齡期婦女中常見的一種盆腔腫瘤，其臨床表現主要為月經過多、習慣性流產等，發生率逐年升高[1]。研究表明子宮肌瘤細胞增殖、凋亡與子宮肌瘤的發生及發展密切相關[2]。因而基于子宮肌瘤發病機制研發治療該疾病的有效藥物具有重要意義。相關報道指出茯苓具有活血化瘀的功效并可用于治療子宮肌瘤、慢性盆腔炎、子宮內膜異位等婦科疾病，但具體作用機制尚未可知[3,4]。研究表明茯苓酸(pachymic acid，PA)是中藥茯苓的有效成分，具有抗炎、抗腫瘤等作用，并可通過抑制腫瘤細胞增殖、遷移等生物學過程發揮抗癌作用[5]。但PA對子宮肌瘤抑制作用的研究尚未見報道。微小RNA-133a(microRNA-133a，miR-133a)在結直腸癌細胞中呈低表達，上調miR-133a的表達可抑制結直腸癌細胞遷移及侵襲[6]。但PA是否能夠通過調控miR-133a的表達從而影響子宮肌瘤發生發展過程尚未可知。腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associatedmacrophage，TAM)分泌的表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)可通過促進表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)表達從而促進上皮性卵巢癌轉移[7]。本研究采用PA作用于子宮肌瘤細胞，探究其在體外抑制子宮肌瘤細胞增殖及誘導凋亡的作用機制，分析其對miR-133a表達的調控作用及其對EGF水平的影響，為PA在子宮肌瘤治療方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑 PA購自上海晶都生物技術有限公司；DMEM培養基購自美國Thermo Fisher公司；胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)購自美國依科賽生物公司；蛋白提取試劑盒均購自陜西碧云天生物工程有限公司；二 喹 啉 甲 酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自美國Pierce公司；miR-133a模擬物(miR-133a mimics)及陰性對照(miR-NC)、miR-133a特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-133a)及陰性對照(anti-miR-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自武漢艾美捷科技有限公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡試劑盒購自上海潤成生物科技有限公司；EGF酶聯免疫吸附檢測試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司；Trizol試劑、反轉錄與熒光定量PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；兔抗人EGFR、CyclinD1、C-caspase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.2研究對象 收集2016年4月至2017年4月病理證實為子宮肌瘤的手術切除標本58例，所有患者均經病理證實為子宮肌瘤；患者術前均未進行放療或化療等治療。患者年齡35～60歲，平均年齡(48.58±8.79)歲，病程2～6年，平均(3.56±1.03)年，子宮肌瘤組織平均體積(168.35±45.87)cm3。

1.1.3納入標準 術中切除離體的宮頸標本置于無RNA酶的EP管內，放入液氮中，術后轉移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2方法

1.2.1子宮肌瘤細胞原代培養 子宮肌瘤組織置于含有雙抗的PBS中培養5 min，剪碎組織，加入Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫浴鍋內消化3 h，待組織塊變小后加入完全培養基終止消化，采用200目細胞篩過濾收集，4℃下1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入新鮮完全培養基，置于37℃、5%CO2培養箱內培養24 h，每隔2 d更換一次培養液，待細胞融合度達到80%時進行傳代培養。子宮肌瘤細胞貼壁生長，分離子宮肌瘤細胞，采用免疫細胞化學法染色鑒定子宮肌瘤細胞，取對數生長期細胞進行后續研究[8]。

1.2.2實驗處理與分組 取對數生長期子宮肌瘤細胞，采用含有10% FBS的DMEM培養基置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內進行培養，用不同濃度的PA(10、20、40、80 μg/ml)處理子宮肌瘤細胞24 h，分別命名為PA 10 μg/ml組、PA 20 μg/ml組、PA 40 μg/ml組、PA 80 μg/ml組[9]。正常培養基培養的子宮肌瘤細胞命名為NC組。MTT實驗檢測各組細胞存活率，選用存活率為50%左右的PA濃度用于后續研究。觀察miR-133a過表達對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡及EGF的影響，實驗分為miR-NC組(miR-NC轉染至子宮肌瘤細胞)、miR-133a組(miR-133a mimics轉染至子宮肌瘤細胞)。后續研究為驗證PA是否通過調控miR-133a的表達而發揮作用，實驗分為PA+anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉染至子宮肌瘤細胞48 h，含有40 μg/ml PA的培養基培養24 h)、PA+anti-miR-133a組(anti-miR-133a轉染至子宮肌瘤細胞48 h，含有40 μg/ml PA的培養基培養24 h)。

1.2.3MTT檢測細胞增殖 取對數生長期子宮肌瘤細胞接種于96孔板(1.0×104個/孔)，棄上清液，按照“1.2.2”藥物處理方法進行分組，每組設置3個復孔，置于培養箱內繼續培養24 h后，每孔加入MTT溶液20 μl(質量濃度為5 mg/ml)，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，微量振蕩器中持續振蕩10 min，于490 nm波長處測定吸光度值(OD值)，細胞存活率(%)=(各實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組子宮肌瘤細胞，預冷PBS清洗，4℃下1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS，4℃下1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μl Binding Buffer重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育15 min，于1 h內置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5qRT-PCR檢測細胞中miR-133a的表達水平 采用Trizol法提取子宮肌瘤細胞RNA，應用Nanodrop 2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度，RNA OD260/OD280值處于1.8～2.0，反轉錄合成cDNA，miR-133a正向引物5′-TTTGGTCCCCTT-CAAC-3′，反向引物：5′-TAGCTATCCTTTGCT-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。PCR擴增：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環。miR-133a以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-133a相對表達量。

1.2.6Western blot檢測CyclinD1、EGFR、C-caspase-3蛋白表達 收集各組子宮肌瘤細胞，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入CyclinD1(1∶1 000)、EGFR(1∶1 000)、C-caspase-3(1∶500)一抗，4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL化學發光劑，暗室內曝光顯影，Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.2.7ELISA法檢測EGF水平 收集各組細胞的培養上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測各組細胞培養上清液中EGF水平。

2 結果

2.1不同濃度PA對子宮肌瘤細胞增殖的影響 實驗結果顯示，與NC組相比，PA 10 μg/ml組、PA 20 μg/ml組、PA 40 μg/ml組、PA 80 μg/ml組子宮肌瘤細胞的細胞存活率均顯著降低(P<0.05)，其中PA 40 μg/ml組細胞存活率為50%左右，因而選用PA 40 μg/ml作為后續研究，見圖1。

2.2PA對子宮肌瘤細胞凋亡和EGF的影響 相對于NC組，PA組子宮肌瘤細胞的細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，EGFR蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，而EGF水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。

2.3PA對miR-133a表達的影響 與NC組比較，PA組子宮肌瘤細胞中miR-133a的表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖3。

2.4高表達miR-133a對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡及EGF的影響 實驗結果顯示，與miR-NC組比較，miR-133a組子宮肌瘤細胞中miR-133a的表達水平顯著升高(P<0.05)，miR-133a的表達上調成功。相對于miR-NC組，miR-133a組子宮肌瘤細胞的細胞存活率顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、EGFR蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，EGF水平顯著降低(P<0.05)，見圖4。

圖1 不同濃度PA對子宮肌瘤細胞增殖的影響Fig.1 Effect of different concentrations of PA on proliferation of uterine fibroid cellsNote:Compared with NC group,*.P<0.05.

圖2 PA對子宮肌瘤細胞凋亡和EGF的影響Fig.2 Effect of PA on uterine fibroid cell apoptosis and EGFNote:A.Detection of apoptosis by flow cytometry;B,C.Western blot detection of C-caspase-3 and EGFR protein expression；D.Detection level of EGF；compared with NC group,*.P<0.05.

圖3 PA對miR-133a表達的影響Fig.3 Effect of PA on the expression of miR-133aNote:Compared with NC group,*.P<0.05.

2.5低表達miR-133a可部分逆轉PA對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡及EGF的影響 與PA+anti-miR-NC組比較，PA+anti-miR-133a組子宮肌瘤細胞中miR-133a的表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞存活率顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，CyclinD1、EGFR蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，而C-caspase-3蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，EGF水平顯著升高(P<0.05)，見圖5。

圖4 高表達miR-133a對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡及EGF的影響Fig.4 Effect of overexpressing miR-133a on uterine fibroid cell proliferation,apoptosis and EGFNote:A.qRT-PCR detection of miR-133a expression level；B.Cell survival rate detected by MTT；C.Detection of apoptosis by flow cytometry;D，E.Western blot for CyclinD1,C-caspase-3,and EGFR protein expression；F.EGF level.Compared with miR-NC group,*.P<0.05.

圖5 低表達miR-133a可部分逆轉PA對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡及EGF的影響Fig.5 Low expression of miR-133a can partially reverse PA′s effects on uterine fibroid cell proliferation,apoptosis and EGFNote:A.qRT-PCR detection of miR-133a expression level；B.Cell survival rate detected by MTT；C.Detection of apoptosis by flow cytometry;D，E.Western blot for CyclinD1,C-caspase-3,and EGFR protein expression；F.EGF level.Compared with PA +anti-miR-NC group,*.P<0.05.

3 討論

子宮肌瘤已嚴重威脅女性身體健康，近年來，隨著生活節奏的加快，子宮肌瘤發病率逐年升高，目前主要采用藥物治療與手術治療，激素類藥物可通過調控內分泌從而達到治療效果，但副作用較大[10-12]。因而尋找安全有效又可最大程度保留子宮的治療方法或治療藥物成為研究重點。本研究通過分析PA對子宮肌瘤細胞增殖及凋亡的影響，為臨床用藥奠定理論基礎。

PA具有抗腫瘤作用，研究表明PA可通過抑制磷脂酰肌醇轉移蛋白的磷酸化從而抑制乳腺癌細胞轉移，或通過抑制蛋白激酶B(Akt)的表達而抑制膽囊癌細胞增殖、遷移及侵襲,以及通過抑制Wnt信號通路激活而抑制腎癌細胞增殖及誘導細胞凋亡[13-15]。但PA對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響尚未可知。本研究結果顯示不同濃度的PA處理子宮肌瘤細胞后，細胞存活率顯著降低，提示PA可抑制子宮肌瘤細胞增殖。有研究表明C-caspase-3蛋白表達水平升高可促進子宮肌瘤細胞凋亡[16]。本研究結果顯示PA可促進子宮肌瘤細胞凋亡，提高C-caspase-3蛋白表達水平，提示PA可能通過上調C-caspase-3的表達而誘導子宮肌瘤細胞凋亡。腫瘤環境中巨噬細胞可被誘導為M2型巨噬細胞(TAM)，研究表明TAM可促進EGF的生成進而促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲，EGF可激活EGFR從而促進腫瘤惡性增殖、血管生成及細胞遷移等過程[17-19]。本研究結果顯示PA可降低EGF、EGFR的表達水平，提示PA可能通過抑制EGF生成從而降低EGFR的表達水平進而抑制子宮肌瘤細胞增殖及促進腫瘤細胞凋亡。

miR-133a在腫瘤中呈低表達，上調miR-133a的表達可抑制腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲[20]。研究表明姜黃素可通過上調miR-133a的表達從而抑制肝癌細胞遷移及侵襲[21]。本研究結果顯示PA處理后，子宮肌瘤細胞中miR-133a的表達水平顯著升高，提示PA可能通過促進miR-133a的表達從而抑制子宮肌瘤細胞增殖及促進腫瘤細胞凋亡。同時本研究結果顯示miR-133a過表達后子宮肌瘤細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，CyclinD1、EGFR、EGF表達水平均顯著降低，C-caspase-3蛋白表達水平顯著升高。研究表明CyclinD1可促進細胞周期由G1期進入S期，在多種腫瘤細胞中呈高表達，促進細胞惡性增殖[22]。本研究結果顯示miR-133a過表達可調控細胞增殖及凋亡及相關蛋白表達，影響EGF水平，抑制miR-133a表達可逆轉PA對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡及EGF的影響。

綜上所述，PA可通過上調miR-133a的表達從而減弱子宮肌瘤細胞增殖能力，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制EGF表達，因此，PA可能成為子宮肌瘤潛在治療藥物。