瑞芬太尼對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠氧自由基、炎癥因子及肺纖維化的影響①

劉 宇 李 耀 萬(wàn)永靈 (四川省人民醫(yī)院麻醉科，成都 610031)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是敗血癥最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，同時(shí)也是全身炎癥反應(yīng)綜合征最易出現(xiàn)的一種器官組織損傷[1]。臨床上表現(xiàn)為肺水腫或低氧血癥[2]。ALI 常見(jiàn)的病理生理機(jī)制包括炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[3]。目前治療ALI的藥物較多，但ALI 的死亡率仍較高[4]。瑞芬太尼是新型超短效μ阿片受體激動(dòng)劑，這種藥物具有起效快、易代謝等特點(diǎn)。Zhang等[5]研究表明：瑞芬太尼具有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的效果。目前對(duì)于瑞芬太尼對(duì)心肌缺血-再灌注損傷保護(hù)的研究較多[6]，但對(duì)于ALI研究較少。本文旨在探究瑞芬太尼對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ALI大鼠氧自由基、炎癥因子及肺纖維化的影響，以期了解瑞芬太尼對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ALI大鼠氧自由基、炎癥因子及肺纖維化的作用機(jī)理，從而為ALI提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 3周齡SPF級(jí)SD大鼠75只，購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，粵監(jiān)證字 2004A029號(hào)。所有大鼠均在本院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.1.2試劑 TRIzol 試劑購(gòu)自Thermo Fisher公司；IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；活性氧基團(tuán)(reactive oxygen species，ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialde-hyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒均購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；Caspase-3抗體購(gòu)自武漢華聯(lián)科有限公司；中性福爾馬林、酒精、 二甲苯購(gòu)自天津科密歐有限公司；Masson染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Red公司。

1.1.3儀器 光學(xué)顯微鏡購(gòu)自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；BS-124s型電子天平購(gòu)自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5 型臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自以色列DNR公司；切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.2方法

1.2.1分組及建立模型 將75只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，隨機(jī)選15只為空白對(duì)照組，其余60只大鼠采用內(nèi)毒素誘導(dǎo)制作ALI模型，制作方法及判斷模型是否成功參考陶振鋼等[7]的研究。具體操作如下：腹腔內(nèi)注射氯氨酮麻醉動(dòng)物后，腹腔注射內(nèi)毒素10 mg/kg，注射量為：2 ml，注射完畢后置動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)喂養(yǎng)，空白對(duì)照組使用同樣的方法腹腔內(nèi)注入同體積的0.9%NaCl溶液。

1.2.2藥物干預(yù) 低劑量瑞芬太尼組于術(shù)后靜脈輸注0.2 μg/(kg·min)瑞芬太尼，持續(xù)30 min；中劑量瑞芬太尼組于術(shù)后靜脈輸注0.6 μg/(kg·min)瑞芬太尼，持續(xù)30 min；高劑量瑞芬太尼組于術(shù)后靜脈輸注1.2 μg/(kg·min)瑞芬太尼，持續(xù)30 min；模型組靜脈輸注與高劑量實(shí)驗(yàn)組等量的0.9%NaCl，空白對(duì)照組不做任何處理。

1.2.3檢測(cè)項(xiàng)目

1.2.3.1肺損傷評(píng)分及肺組織W/D值 肺損傷評(píng)分項(xiàng)目包括：支氣管內(nèi)出血和碎屑、充血、水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞增生，按損傷程度分為0、1、2和3分。取大鼠左下葉肺組織，使用生理鹽水充分漂洗后使用濾紙吸干多余水分，稱(chēng)濕重，80℃烘干24 h 稱(chēng)干重，計(jì)算肺組織濕/干重比值(W/D)。

1.2.3.2RT-PCR 用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，用SYBR PCR Master Mix試劑盒對(duì)Caspase-3表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.3.3Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各檢測(cè)需要蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3.4氧自由基檢測(cè) 使用10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血分離血清0.5 ml，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)ROS、MDA、TNF-α、IL-1β含量水平。

1.2.3.5炎癥因子檢測(cè) 從大鼠頸總動(dòng)脈插管接取0.5 ml血液，按照IL-6、IL-1β及TNF-α試劑盒子上的操作方法使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)大鼠血清中的IL-6、IL-1β及TNF-α含量。

1.2.3.6Masson染色 將各組大鼠部分肺組織用石蠟包埋做成石蠟切片，按照Masson染色試劑盒方法，將切片用蒸餾水沖洗，依次浸入二甲苯和不同濃度梯度的乙醇溶液，并用無(wú)水乙醇脫水處理，按照說(shuō)明書(shū)依次用試劑盒中的A、B染色液染色，清洗；最后加入E染液，用乙醇和二甲苯進(jìn)行透明處理，中性樹(shù)脂封片，在光鏡下分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)分析和作圖采用的軟件為SPSS22.0和GraphPad Prism5，使用單因素方差分析，若P<0.05則表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1Caspase-3表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 由圖1可見(jiàn)，相比空白對(duì)照組，模型組大鼠Caspase-3 mRNA及Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量瑞芬太尼組大鼠Caspase-3 mRNA及Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；相比低劑量瑞芬太尼組，中劑量瑞芬太尼組大鼠Caspase-3 mRNA及Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；相比中劑量瑞芬太尼組，高劑量瑞芬太尼組大鼠Caspase-3 mRNA及Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

2.2大鼠肺部損傷檢查結(jié)果 由圖2可以看出，相比空白對(duì)照組，模型組大鼠肺損傷評(píng)分、濕/干重比值顯著升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量瑞芬太尼組大鼠肺損傷評(píng)分、濕/干重比值顯著降低(P<0.05)；相比低劑量瑞芬太尼組，中劑量瑞芬太尼組大鼠肺損傷評(píng)分、濕/干重比值顯著降低(P<0.05)；相比中劑量瑞芬太尼組，高劑量瑞芬太尼組大鼠肺損傷評(píng)分、濕/干重比值顯著降低(P<0.05)。

2.3氧自由基檢測(cè)結(jié)果 由圖3可以看出，相比空白對(duì)照組，模型組大鼠SOD水平顯著降低，ROS、LDH、MDA水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量瑞芬太尼組大鼠SOD水平顯著升高，ROS、LDH、MDA水平顯著降低(P<0.05)；相比低劑量瑞芬太尼組，中劑量瑞芬太尼組大鼠SOD水平顯著升高，ROS、LDH、MDA水平顯著降低(P<0.05)；相比中劑量瑞芬太尼組，高劑量瑞芬太尼組大鼠SOD水平顯著升高，ROS、LDH、MDA水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 Caspase-3表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Test results of Caspase-3 expressionNote:A.The expression of Caspase-3 mRNA in each group；B.The relative expression quantity of Caspase-3 protein;C.Western blot picture of Caspase-3 protein.Compared with control group,*.P<0.05；compared with Endotoxin group,#.P<0. 05.

2.4炎癥因子檢測(cè)結(jié)果 由圖4可以看出，相比空白對(duì)照組，模型組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量瑞芬太尼組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低(P<0.05)；相比低劑量瑞芬太尼組，中劑量瑞芬太尼組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低(P<0.05)；相比中劑量瑞芬太尼組，高劑量瑞芬太尼組大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低(P<0.05)。

2.5Masson染色觀察纖維化及α-SMA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 由圖5A可以看出，空白對(duì)照組的大鼠肺組織細(xì)胞排列緊密有序；模型組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯的組織纖維化，并伴隨有組織損傷；使用瑞芬太尼處理的各組大鼠肺組織也出現(xiàn)組織纖維化，與模型組相比，肺組織的纖維化和損傷明顯得到改善。由圖5B可以看出，相比空白對(duì)照組，模型組大鼠α-SMA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量瑞芬太尼組大鼠α-SMA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；相比低劑量瑞芬太尼組，中劑量瑞芬太尼組大鼠α-SMA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；相比中劑量瑞芬太尼組，高劑量瑞芬太尼組大鼠α-SMA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖2 大鼠肺部損傷檢查結(jié)果Fig.2 Test results of lung injury in ratsNote:A.The lung injury scores；B.Wet/dry weight of lung tissue. Compared with control group,*.P<0.05；compared with Endotoxin group,#.P<0.05.

圖3 氧自由基檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Test results of oxygen radicalsNote:A.The SOD content；B.The ROS content；C.The LDH content；D.The MDA content. Compared with control group,*.P<0.05；compared with Endotoxin group,#.P<0.05.

圖4 炎癥因子檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Test results of inflammatory factorsNote:A.The TNF-α content；B.The IL-β content；C.The IL-6 content.Compared with control group,*.P<0.05；compared with Endotoxin group,#.P<0.05.

圖5 Masson染色觀察纖維化及α-SMA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Test results of fibrosis and α-SMA expression observed by Masson stainingNote:A.The results of Masson staining；B.The results of α-SMA expression. Compared with control group,*.P<0.05;compared with Endotoxin group,#.P<0.05.

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種有序或程序性的細(xì)胞死亡，這種程序性死亡是受相關(guān)基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)性死亡過(guò)程[8]。其中Caspase是細(xì)胞凋亡的核心，Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子[9]。Caspase-9基因處于Caspase 家族激活基因的頂端，是Caspase家族中最常見(jiàn)的凋亡啟動(dòng)子，通過(guò)自身的裂解使得 proCaspase-3 產(chǎn)生有活性的 Caspase-3。這種有活性的 Caspase-3是執(zhí)行凋亡的基因，主要作用機(jī)理是通過(guò)剪切另外的 Caspase 底物引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用瑞芬太尼處理各組大鼠Caspase-3 mRNA及Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低，說(shuō)明瑞芬太尼可抑制細(xì)胞的凋亡，保護(hù)大鼠肺組織。金小雪等[11]研究表明：瑞芬太尼可抑制細(xì)胞的凋亡，與本研究得出的結(jié)論相一致。

目前對(duì)ROS的研究越來(lái)越成熟，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 ROS 的堆積過(guò)量是導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷的重要機(jī)制之一[12]。高婷等[13]研究表明，在健康的細(xì)胞內(nèi)ROS的水平是一定的，但若體內(nèi)存在氧化應(yīng)激，則細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的ROS并破壞線(xiàn)粒體膜和細(xì)胞膜的完整性對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SOD、GPX 等酶的大量釋放至細(xì)胞外。因此，ROS損傷被認(rèn)為是引起細(xì)胞氧化損傷的主要機(jī)制。目前在機(jī)體內(nèi)源性抗氧化體系中，關(guān)于抗氧化酶體系的研究較為深入，但最常見(jiàn)的一組抗氧化酶體系為：SOD/GPX/CAT 反應(yīng)系統(tǒng)是主要的一組抗氧化酶體系。SOD/GPX/CAT它們分工合作共同抵御機(jī)體受到外源或內(nèi)生的氧化應(yīng)激損傷。SOD分為3 種亞型SOD1、SOD2、SOD3，主要將活性氧轉(zhuǎn)換成 H2O2，然后 GPX 和 CAT 將 H2O2解離成水[14]。崔笑梅等[15]研究表明：上調(diào) SOD 基因的表達(dá)將增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，導(dǎo)致嚴(yán)重的氧化損傷。本研究可以看出，相比模型組，使用瑞芬太尼處理各組大鼠，SOD含量水平顯著升高，ROS、LDH、MDA水平顯著降低，且隨著使用瑞芬太尼劑量的增加效果越顯著，說(shuō)明瑞芬太尼可以顯著抑制大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，且呈劑量依賴(lài)性。研究表明：瑞芬太尼可以抑制體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，與本研究得出的結(jié)論相一致。張靜[16]研究表明：細(xì)胞因子主要可分為促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子兩種。目前研究較多的促炎性細(xì)胞因子包括：TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8 等；抗炎性細(xì)胞因子則包括：IL-4、IL-10、白介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)、TNF結(jié)合蛋白(TNF-BP)和可溶性TNF 受體(TNF-sr)等，本研究中主要研究TNF-α、IL-1β、IL-6這幾種炎癥因子。Cen等[17]研究表明：IL-1β、IL-6、TNF-α是重要的促炎性細(xì)胞因子，它們主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞等分泌，是炎癥的重要介導(dǎo)物質(zhì)。本研究可以看出，相比模型組，使用瑞芬太尼處理各組大鼠，TNF-α、IL-6、IL-1β含量水平顯著降低，且隨著使用瑞芬太尼劑量增加下降更為顯著。說(shuō)明瑞芬太尼可以有效降低大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，且呈劑量依賴(lài)性。杜成等[18]研究表明：瑞芬太尼可以抑制炎癥反應(yīng)，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述，瑞芬太尼可以有效減輕大鼠因內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷，其作用機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)并抑制肺組織細(xì)胞的凋亡有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)僅在大鼠上進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將擴(kuò)大在臨床上檢測(cè)瑞芬太尼的作用效果。