黨參多糖抑制PI3K/AKT通路對人肝癌HepG2細胞生長和運動能力的影響

劉云鶴 蔡金保 王紅麗 (河南省南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院腫瘤內科，南陽 473000)

肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球最常見的三大癌癥死亡原因之一，盡管在預防、篩查、診斷和治療新技術方面均取得進展，但因其具有很強的生長增殖、黏附和侵襲轉移能力，發病率和死亡率仍不斷上升[1]。在全世界范圍內，每年約有60萬人死于肝癌，隨腫瘤負荷和轉移情況的不同，其治療方案也不盡相同，尤其對于肝癌晚期的治療費用昂貴且效果不佳[2,3]。黨參多糖(codonopsis pilosula polysaccharides,CPP)是其有效成分之一，具有廣泛的生物活性。大量研究表明，黨參多糖具有免疫調節、抗病毒、保肝、抗氧化應激和神經保護等功能[4-9]。目前其對腫瘤的作用研究并不多見，研究表明，其對乳腺癌、宮頸癌等腫瘤細胞能產生抑制作用[10,11]。Bai等[12]研究發現，黨參提取所得的兩種水溶性多糖對肝癌HepG2表現出抑制作用，其機制與誘導細胞周期阻滯和凋亡蛋白表達、抑制細胞遷移相關。眾所周知，PI3K能活化AKT，參與調控細胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種信號傳導。在對前列腺癌的研究中發現，PI3K/AKT參與了細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲，是癌癥治療的新途徑[13]。黨參多糖能否通過PI3K/AKT通路對人肝癌細胞產生影響還未見報道。因此，本文以體外培養的人肝癌HepG2細胞為研究對象，研究黨參多糖對人肝癌HepG2細胞生長和運動能力的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系與主要試劑 人肝癌HepG2細胞株購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心；DMEM培養液、胎牛血清、0.25%胰酶購自賽默飛世爾公司；DMSO購自上海生工；黨參多糖(純度≥98%)、RIPA裂解液購自美國Sigma公司；Transwell小室購自北京優尼康生物技術有限公司；Matrix基質膠購自BD公司；BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司；單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記二抗購自Santa Cruze公司。

1.1.2主要儀器設備 恒溫培養箱購自美國ThermoForma公司；電泳儀和半干轉膜儀購自美國伯樂公司；Gel View 6000化學發光凝膠成像系統購自廣州云星儀器有限公司；普通光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；FACSAria流式細胞儀購自美國BD公司；超凈工作臺購自蘇州中亞凈化設備有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 用含有10%胎牛血清的DMEM培養基，將HepG2細胞培養于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中。鏡下觀察細胞生長狀態，細胞融合率達80%時可傳代。

1.2.2CCK8實驗 將人肝癌HepG2細胞調整到2×104個/ml密度接種于96孔板，每孔加入100 μl，待細胞貼壁后，分別給予對應終濃度黨參多糖(CPP)，每個劑量組設6個復孔，按實驗設計培養對應時間之后每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續孵育4 h。采用450 nm吸光度于酶標儀上測定各組人肝癌HepG2細胞存活率。

1.2.3流式細胞術 以1×105個/ml密度將人肝癌HepG2細胞接種于6孔板中，待細胞融合率達80%以上時用胰酶處理并收集細胞，調整密度為1×106個/ml。嚴格按照FITC-Annexin V試劑盒說明書，每個樣本加入5 μl的FITC-Annexin V和PI染色液，室溫避光孵育15 min后，上機檢測。

1.2.4Transwell實驗 Transwell小室下層加入含胎牛血清培養液，以1×105個/ml密度將人肝癌HepG2細胞接種于提前用Matrigel基質膠包被好的Transwell小室上層，上層培養液不加胎牛血清。培養24 h后，無菌拭去Matrigel基質膠和小室上層細胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，用結晶紫染色細胞，流水沖洗后自然晾干。鏡下隨機選取5個視野計數。實驗至少重復3次，設6個復孔。

1.2.5劃痕實驗 用記號筆在12孔板背面畫出5條平行直線，滅菌備用。以1×105個/ml密度將人肝癌HepG2細胞接種于滅菌12孔板中。待細胞貼壁后，用10 μl槍頭垂直于記號筆橫線劃痕，PBS清洗3次。給予對應終濃度藥液處理后繼續培養24 h。隨機選取5個視野觀察并拍照。

1.2.6蛋白印跡實驗 用RIPA蛋白裂解液于冰上提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白變性后，取等量蛋白行SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜。棄去殘液，清洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。滴加ECL于暗室曝光顯影，以GAPDH為內參。

2 結果

2.1黨參多糖對體外培養HepG2細胞存活率的影響 CCK8法檢測人肝癌HepG2細胞存活情況，結果顯示：與Control組相比，50 μmol/L及以上濃度組細胞存活率的組間差距具有統計學意義(P<0.05，圖1)，且細胞的存活率隨著CPP濃度增加而降低；而其他濃度組細胞的存活率組間差異無統計學意義。表明黨參多糖能劑量依賴性的降低HepG2細胞的存活率，而當終濃度達到50 μmol/L時可出現明顯的細胞毒性作用。故選擇無明顯細胞毒作用的三個最大濃度進行后續試驗，即5、10和20 μmol/L。

2.2黨參多糖對體外培養HepG2細胞凋亡率的影響 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況，結果表明：與Control組相比，CPP處理組培養HepG2細胞后，細胞凋亡率明顯增加(P<0.05，圖2)，且隨著黨參多糖處理濃度增大，HepG2細胞凋亡率也隨著增加。

2.3黨參多糖對體外培養HepG2細胞遷移的影響 劃痕實驗檢測黨參多糖對HepG2細胞轉移的影響，結果如圖3所示，與Control組相比，經CPP處理24 h后各劑量組劃痕愈合率隨CPP濃度增大而明顯降低(P<0.01)，且與黨參多糖濃度呈反比。

2.4黨參多糖對體外培養HepG2細胞侵襲的影響 Transwell檢測黨參多糖對HepG2細胞侵襲的影響，結果顯示：與Control組相比，經CPP處理后，各劑量組鏡下觀察侵襲細胞數量明顯減少(P<0.01，圖4)，且CPP濃度越大，侵襲細胞數越少。

2.5黨參多糖對體外培養HepG2細胞上皮間質轉化相關蛋白表達的影響 Western blot檢測HepG2細胞上皮間質轉化相關蛋白的表達情況，結果如圖5所示：與Control組相比，CPP處理組細胞上皮標記蛋白E-cadherin表達明顯上調(P<0.01)，間質標記蛋白N-cadherin和Vimentin的表達明顯下調(P<0.01)，這種調節作用與黨參多糖濃度相關。提示，黨參多糖能劑量依賴性的抑制HepG2細胞的上皮間質轉化能力。

圖1 CPP對HepG2細胞存活率的影響Fig.1 Effect of CPP on cell viability of HepG2 cellsNote:Compared with Control group，*.P<0.05.

圖2 CPP對HepG2細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of CPP on apoptosis rate of HEPG2 cellsNote:Compared with Control group，*.P<0.05.

2.6黨參多糖對體外培養HepG2細胞信號通路的影響 Western blot檢測HepG2細胞信號通路相關蛋白的表達情況，結果如圖6所示：與Control組相比，CPP處理組細胞p-PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表達水平被明顯抑制(P<0.05)，且這種抑制作用與黨參多糖濃度呈正比。表明，黨參多糖能劑量依賴性的抑制p-PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表達，從而影響PI3K/AKT信號通路。

圖3 CPP對HepG2細胞遷移的影響Fig.3 Effects of CPP on invasion ability of HepG2 cellsNote:Compared with Control group，*.P<0.05.

圖4 CPP對HepG2細胞侵襲的影響Fig.4 Effects of CPP on migration ability of HepG2 cellsNote:Compared with Control group，*.P<0.05.

圖5 CPP對HepG2細胞上皮間質轉化相關蛋白表達的影響Fig.5 Effect of CPP on expression of epithelial-mesenchymal transition-related protein in HepG2 cellsNote:Compared with Control group，*.P<0.05.

圖6 CPP對HepG2細胞信號通路的影響Fig.6 Effect of CPP on signaling pathway in HepG2 cellsNote:Compared with Control group，*.P<0.05.

圖7 CPP與740Y-P共處理對HepG2細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力影響Fig.7 Effect on proliferation,apoptosis,invasion and migration of HepG2 cells after treated by CPP and/or 740Y-PNote:A.Cell proliferation detected by CCK-8;B.Detection of apoptosis by flow cytometry;C.Cell invasion detected by Transwell test;D.Cell migration detected by scratch test;E，F.Protein expression of EMT-related and signaling pathway tested by Western blot；G.The statistics of protein expression of EMT-related and signaling pathway.Compared with Control group，*.P<0.05；compared with 740Y-P group，#.P<0.05.

2.7CPP、740Y-P單用或聯用對HepG2細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 在有/沒有PI3K激活劑740Y-P的情況下檢測20 μmol/L黨參多糖對HepG2細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響，結果如圖7所示：與Control組相比，20 μmol/L黨參多糖能明顯抑制HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡(P<0.05)；而740Y-P與黨參多糖對HepG2細胞的作用正好相反(P<0.05)；而兩者聯用時，與740Y-P 組相比，20 μmol/L黨參多糖能逆轉740Y-P對HepG2細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用(P<0.05)。

3 討論

原發性肝癌是起源于肝臟上皮或間葉組織的惡性腫瘤，隨著人們生活水平的提高，肝癌發病率呈逐年上升趨勢，且越來越年輕化，其發病是多因素、多步驟綜合作用的結果。研究表明，PI3K/AKT通路的異常激活常與細胞轉化、腫瘤發生、癌癥發展以及藥物耐藥性有關，因此臨床上有許多靶向該通路的藥物單獨或聯合用于實體瘤和血液惡性腫瘤的治療中[14]。比如激活PI3K/AKT信號通路能增加結腸癌SW480細胞對順鉑的耐藥性[15]。近年來，對天然提取物的抗癌作用研究越來越多。研究表明，在人結腸癌HT-29細胞中，白茅苷能明顯抑制人結腸癌HT-29細胞和胃癌SGC-7901細胞的生長，且能通過上調p53和半胱天冬氨酸酶(Caspase)級聯誘導細胞凋亡[16,17]。而黨參多糖也具有包括抗癌在內的多種生物學活性，因此本文以體外培養的人肝癌HepG2細胞為研究對象，探討黨參多糖能否通過PI3K/AKT信號通路對人肝癌HepG2細胞產生抑制作用。

細胞異常增殖和凋亡抑制是腫瘤發生的重要特點，因此抑制其增殖和促進其凋亡發生是抗癌藥開發的重要思路。研究表明，許多天然提取物對體外培養的腫瘤細胞能表現出抑制作用。Hui等[18]研究發現，高良姜石油醚餾分得到的益智油通過上調PTEN表達、下調PI3K/AKT磷酸化誘導細胞凋亡而對多種肝癌細胞系的生長呈濃度和時間依賴性的抑制作用。研究表明，黨參多糖對乳腺癌細胞系BT549、MDA-MB-231和宮頸癌細胞系Hela均能表現出明顯的抑制增殖作用；且能通過上調Bax/Bcl-2比值和Caspase-3表達來誘導腫瘤細胞凋亡發生[10,12]。我們的研究也發現，黨參多糖50 μmol/L及以上濃度對人肝癌HepG2細胞會產生明顯的細胞毒性，5、10和20 μmol/L濃度均能明顯抑制HepG2細胞增殖和促進細胞凋亡。目前對黨參多糖的研究并沒有深入到單糖成分的活性研究層面，且不同的提取和分離純化方法得到的黨參多糖含量大不相同，既往研究確定了其主要成分包括鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、核糖、甘露糖、果糖、木糖和葡萄糖等[19]，在本文中黨參多糖對HepG2細胞的毒性或活性來源尚不明確，還有待進一步研究。

抑制腫瘤細胞侵襲和轉移是抗癌藥的又一重要靶點。研究表明，五味子乙素能抑制P-AKT、p-mTOR和MMP-9的表達，劑量依賴性的抑制惡性膠質瘤細胞系U251和U87細胞的遷移和侵襲[20]。上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞失去極性和細胞獲得間質特性從而增加細胞轉移和侵襲能力的過程[21,22]，是多種腫瘤發生轉移和侵襲的重要過程。E-cadherin是一種重要的細胞黏附因子，參與并介導細胞之間相互黏附，與多種腫瘤的侵襲轉移有不可分割的聯系，它的低表達或者表達缺失被認為是腫瘤上皮間質轉化的關鍵步驟。為了進一步探討黨參多糖對HepG2細胞的作用，我們檢測了細胞遷移、侵襲和EMT相關蛋白的表達水平，結果表明：黨參多糖明顯抑制HepG2細胞的遷移和侵襲能力，并下調間質標記蛋白、上調上皮間質蛋白表達，從而抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。

眾所周知，PI3K隸屬于磷脂激酶家族，機體內多種生長因子均能激活PI3K產生第二信使PIP3，進而結合活化含有PH結構域的蘇氨酸激酶AKT，參與調控細胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種信號傳導，其中也包括癌癥[23]。研究表明，調節PI3K/AKT通路能影響三陰性乳腺癌(triple-nagative breast cancer,TNBC)細胞的增殖、侵襲和遷移能力，抑制大腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時促進其細胞凋亡[24,25]。Liu等[26]研究發現，苦參堿(Oxymatrine,OMT)和/或奧沙利鉑(OXA)聯用處理結腸癌細胞系HT29和SW480，能通過降低PI3K/AKT通路相關蛋白表達而誘導結腸癌細胞發生凋亡。我們的研究也證實，PI3K/Akt信號通路的磷酸化激活降低是黨參多糖抑制HepG2細胞生長和運動能力的作用機制，但黨參多糖對HepG2細胞的這種作用是否還有其他信號通路的參與還有待進一步研究。

本文研究表明，黨參多糖能抑制體外培養的人肝癌HepG2細胞增殖、侵襲和遷移能力，并促進其細胞凋亡發生；影響上皮間質轉化相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達上皮和下調PI3K/AKT信號通路的磷酸化激活；還能在單用或與PI3K激活劑740Y-P聯用時表現出對HepG2細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的抑制作用。綜上所述，黨參多糖能通過抑制PI3K/AKT信號通路活化實現對人肝癌HepG2細胞生長和運動能力的抑制作用。因此，黨參多糖可能是一種潛在的治療肝癌的藥物，但對其單糖成分及在黨參多糖活性成分中的角色還需要進行深入的研究。