1-芘丁酸單克隆抗體的制備及免疫學性能鑒定①

胡驍飛 孔蒙蒙 邢廣旭 邢云瑞 孫亞寧 張改平

(河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002)

1-芘丁酸(1-Pyrenebutyric acid,PBA)是多環芳烴最常見的一種衍生物[1]，由有機物的熱解和不完全燃燒產生，主要存在于水、空氣和土壤中[2]。食品由于原料產地污染程度及加工方式不同，PBA含量也會產生差異[3]，人類主要通過皮膚、呼吸、受污染的水和食物攝入等途徑接觸多環芳烴[3-5]。多環芳烴具有強烈致癌性、致畸性和致突變性，在人體內的代謝產物可以和DNA分子發生共價結合，使細胞中DNA的復制出現錯誤，增加突變的概率，導致癌癥的發生，對人體造成極大的危害[6-8]。PBA還具有雌激素的作用，危害機體免疫系統，損害機體生殖健康[9]。鑒于此，美國環境保護署將多環芳烴列為需要優先控制的污染物[10]，我國也將其列入“中國環境優先污染物黑名單”[11]。

目前，檢測多環芳烴及其衍生物的方法主要是理化檢測，包括高效液相色譜法、氣相色譜法、熒光法、電泳法以及各種衍生方法[12-15]。理化檢測靈敏度及準確度均比較高，因此其檢測結果常常可以作為解決食品安全爭端及國際貿易爭端的仲裁依據；但理化檢測樣品前處理過程比較繁瑣，檢測耗時長，費用高，且儀器比較昂貴，對操作者技術要求高，限制了其應用。免疫學檢測技術是利用抗原和抗體之間的特異性反應并結合各種標記技術建立的檢測技術，具有靈敏度高、特異性好、耗時短及檢測費用低等優點，且儀器相對便宜，因此在食品安全監控、環境保護、疫病診斷領域得到了廣泛的應用[16,17]。本試驗擬通過細胞融合技術篩選出分泌抗PBA單克隆抗體的雜交瘤細胞株，從而制備靈敏度高、特異性強的PBA單克隆抗體，為建立PBA的免疫學快速檢測方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 PBA(純度97%) 購自Alfa Aesar公司；PBA甲醇、萘購自Innochem公司；1-芘甲醛購自Aladdin公司；菲購自Ark公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、卵清蛋白(ovalbumin,OVA)購自BDH公司；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)購自Sigma公司；RMPI-1640細胞培養基、HT培養基、HAT培養基購自Solarbio科技有限公司；其他試劑均為市售分析純(AR)。磷酸鹽緩沖液(PBS)、碳酸鹽緩沖液(CBS)、PBS+Tween-20洗液(PBST)、封閉液、顯色液、終止液由河南省農科院動物免疫學重點實驗室配制。

1.1.2實驗動物 6～7周齡SPF級BALB/c雌性小鼠購自鄭州大學醫學院，由河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室飼養。

1.2方法

1.2.1PBA人工抗原的制備及質量鑒定

1.2.1.1PBA人工抗原的制備 EDC法制備PBA的免疫原PBA-BSA和包被原PBA-OVA，具體如下：稱取PBA 5 mg溶于0.5 ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入等摩爾質量的NHS和EDC，室溫反應0.5 h。稱取載體蛋白BSA 14.4 mg溶于2 ml的PBS緩沖液中，取上述PBA溶液逐滴加入BSA溶液中，室溫反應4～5 h后，4℃對PBS緩沖液透析3 d(每天換透析液3次)，5 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，取上清液，保存到-20℃冰箱中備用。具體路線見圖1。包被原PBA-OVA的合成方法與此相同。

1.2.1.2PBA人工抗原的鑒定 根據文獻[18]，分別采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法及動物免疫法對制備的人工抗原進行質量鑒定。

動物免疫鑒定時，用制備的免疫原免疫BALB/c雌性小鼠，免疫劑量為10 μg蛋白/只，每次200 μl，背部皮下4～6點注射，共免疫4次。首先將100 μl濃度為200 μg/ml的人工抗原PBA-BSA與等量FCA混合均勻，完全乳化；后三次免疫將FCA換成FIA，其他步驟完全一致。免疫間隔21 d。最后一次免疫10 d后斷尾采血10 μl，加入到990 μl PBS中，混勻，5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清保存到-20℃冰箱中備用。間接ELISA測定血清效價，間接競爭(阻斷)ELISA測定靈敏度，選擇效價高和靈敏度好的小鼠進行細胞融合。

1.2.2細胞融合和雜交瘤細胞的篩選 選擇效價和靈敏度良好的小鼠進行超免，超免劑量為50 μg蛋白/只，將PBA-BSA用高壓滅菌的PBS緩沖液稀釋到250 μg/ml，取200 μl腹腔注射到用于細胞融合的小鼠，超免3 d后取其脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，融合過程參照文獻[18]，并做了微小修改，使用的骨髓瘤細胞為SP2/0。間接ELISA和阻斷ELISA對雜交瘤細胞株進行篩選。

1.2.3PBA單抗的制備及免疫學特性鑒定

1.2.3.1PBA單抗制備 采用體內誘生腹水法制備單克隆抗體[16]。對健康的BALB/c小鼠腹腔注射500 μl滅菌的液體石蠟，10 d后將細胞株以5×105/500 μl的劑量注射到小鼠腹腔內，7～10 d后采集小鼠腹水，5 000 r/min離心10 min。-20℃冰箱保存備用。

1.2.3.2PBA單抗免疫學特性鑒定 單抗效價采用間接ELISA測定。單抗靈敏度測定：分別配制濃度為5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078 125、0 ng/ml的PBA標準品溶液，以間接競爭ELISA測定抗體靈敏度。單抗亞型鑒定按照單克隆抗體亞型試劑盒鑒定步驟進行操作；單抗親和力測定:根據參考文獻[18]把PBA-OVA稀釋到1 μg/ml和0.5 μg/ml進行包板，采用間接ELISA法對單克隆抗體親和力進行測定，計算其親和力常數Ka值；單抗特異性測定：間接競爭ELISA測定單克隆抗體與PBA的類似物1-芘甲醇、1-芘甲醛、苯并芘、菲、萘、芘以及BSA和OVA之間的交叉反應。

圖1 PBA-BSA合成路線Fig.1 Synthesizing route of PBA-BSA

2 結果

2.1PBA人工抗原的質量鑒定

2.1.1PBA-BSA的SDS-PAGE 人工抗原PBA-BSA的SDS-PAGE結果見圖2。BSA比PBA-BSA移動的稍微快一些，根據SDS-PAGE原理，分子量小的物質比分子量大的物質移動速度要快，因此PBA-BSA分子量應比BSA要稍大一些，初步證明PBA成功偶聯到BSA上。

2.1.2PBA-BSA免疫小鼠血清效價及靈敏度 免疫小鼠血清效價測定結果見表1。由表1可知，第4次免疫10 d后，免疫的4只小鼠均產生了抗體，血清效價在1.6×103～1.28×104在之間。其中1和4號小鼠效價均達到1.28×104。

圖2 BSA PBA-BSA 的SDS-PAGE圖Fig.2 The SDS-PAGE map of BSA PBA-BSANote: 1.BSA；2.PBA-BSA；3.Marker protein.

表1 免疫小鼠血清效價

Tab.1 Serum titer of immunized mice

NO.2004008001 6003 2006 40012 800Blank11.4301.2540.9390.8650.8070.4910.2910.1320.7040.5520.2890.1810.0410.0390.0320.02830.6800.5600.3880.2080.0590.0460.0260.01841.6501.6291.2051.0130.7490.4960.2420.021

免疫小鼠血清靈敏度測定結果見表2。由表2可知，4只小鼠血清抗體都能夠被PBA抑制，半數抑制濃度(IC50)在150～4.69 ng/ml，其中4號小鼠的IC50最好，由其抑制曲線(圖3)計算IC50為4.77 ng/ml。此結果表明，本實驗采用的偶聯方法正確，成功制備出了PBA人工抗原。4號小鼠的血清效價最高，且靈敏度最好，因此選擇4號小鼠用作細胞融合。

2.2PBA單克隆抗體(PBA-mAb)特性鑒定

2.2.1PBA-mAb 效價 4號小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合后，經過有限稀釋法亞克隆和ELISA篩選，最后得到1株能夠穩定分泌抗PBA-mAb的雜交瘤細胞10C2A6，通過體內誘生腹水法批量制備出抗體。間接ELISA測定了腹水效價，細胞上清的效價為1∶1 600，腹水的效價為1∶2.56×105。

2.2.2PBA-mAb靈敏度 PBA-mAb靈敏度測定結果線性回歸方程為y=-0.422 9x+0.471 4，R2=0.987 2，經計算，其IC50為0.86 ng/ml(圖4)。

2.2.3PBA-mAb亞型 采用單克隆抗體亞型測定試劑盒對PBA-mAb的亞型進行了鑒定，結果如圖5所示，PBA-mAb的亞型為IgG2b型。

2.2.4PBA-mAb親和力 PBA-mAb親和曲線如圖6 所示，當包被原濃度為1.0 μg/ml和0.5 μg/ml時，PBA-mAb與抗原結合達到50%飽和狀態時的濃度分別為3.16 μg/ml和2.85 μg/ml，通過親和常數公式計算出親和常數Ka為1.96×109L/mol。

圖3 4號小鼠血清抑制曲線Fig.3 Serum inhibitory curve of No.4 mouse

表2 免疫小鼠血清靈敏度

Tab.2 Serum sensitivity of immunized mice

No.PBA concentration (ng/ml)300150753718.759.384.692.34PositiveBlank10.410.4310.7240.7490.8521.0121.0011.1321.2340.02520.1680.2740.3880.5420.6320.8940.9511.1121.0320.01530.0640.0940.1020.1480.3560.4780.6320.8030.8750.02340.0140.0360.0680.1320.2380.4780.5320.6831.0460.004

圖4 PBA-mAb的抑制曲線Fig.4 Inhibition curve of PBA-mAb

圖5 PBA-mAb亞型鑒定Fig.5 Subtype identification of PBA-mAb

2.2.5PBA-mAb特異性 PBA-mAb特異性測定結果如表3所示，由表可知1-芘丁酸的IC50為0.86 ng/ml，與1-芘甲醇、1-芘甲醛以及芘的交叉反應率分別為0.63%、1.42%和1.74%，與菲、萘、苯并芘、BSA以及OVA的交叉反應率均小于0.05%。因此PBA-mAb具有良好的特異性。

3 討論

PBA相對分子量為288.34,屬于小分子半抗原化合物，由于其自身結構簡單，不具有免疫原性，因此不能直接刺激機體產生抗體[19]。為了獲得抗PBA的抗體，必須將其與大分子載體蛋白如BSA、OVA及鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)或者非抗原性的多聚賴氨酸等物質進行偶聯制備人工抗原，才能刺激機體產生相應的抗體。由于PBA含有羧基，可以與載體蛋白的氨基進行縮合，因此本研究中直接采用了EDC法進行人工抗原制備。通過動物免疫及血清檢測，制備的人工抗原免疫動物能夠產生抗PBA抗體，說明采用EDC法制備PBA的人工抗原是可行的，能夠制備出符合質量要求的人工抗原，為PBA-mAb的制備奠定了良好基礎。

圖6 PBA-mAb親和曲線Fig.6 Affinity curve of PBA-mAb

表3 PBA-mAb特異性

Tab.3 Specificity of PBA-mAb

CompoundsIC50(ng/ml)Cross reactivity (%)PBA0.86100.00Pyrene49.501.741-Pyrenecarboxaldehyde60.461.421-Pyrenemethanol137.400.63Phenanthrene2 099.94<0.05Naphthalene>1.00×104<0.05Benzoapyrene>1.00×104<0.05BSA>1.00×104<0.05OVA>1.00×104<0.05

PBA-mAb制備過程中，特異性鑒定至關重要，如果只是用間接ELISA進行效價鑒定篩選，所制備的單克隆抗體可能效價比較高，但特異性不一定強。筆者多年的抗體制備研究工作經驗表明，抗體效價高不一定能夠保證抗體針對相應的小分子半抗原具有很強的特異性。抗原和抗體特異性結合的分子機制是抗原分子表面存在著能與抗體相互作用的部位，即抗原決定簇，是抗原決定簇的空間結構與抗體分子超變區互補以及氫鍵、疏水性、靜電作用等形成的低能勢共同作用的結果，即抗體是從抗原決定簇的立體結構，而不是從抗原的全面分子排列來“認識”抗原的[20]。因此，小分子半抗原的空間構像對抗體免疫學特性有決定性影響。在小分子半抗原偶聯制備人工抗原的過程中可能會使小分子的抗原決定簇結構發生改變，且小分子半抗原只有一個抗原決定簇[21]，因此小分子的抗原決定簇結構發生變化意味著用制備的人工免疫原免疫動物時產生的抗體，并不一定是完全針對小分子的，甚至與小分子沒有任何特異性反應。由于載體蛋白與小分子半抗原偶聯來制備人工免疫原和人工包被原時，所制備的人工免疫原和人工包被原中小分子結構基本完全一致，因此人工免疫原免疫動物后，用相應的人工包被原檢測抗體效價時，顯示抗體效價比較高。如果想要得到效價高、特異性強的單克隆抗體，必須在細胞融合時對雜交瘤細胞同時進行間接ELISA的效價篩選和阻斷ELISA的特異性篩選，這樣才能保證所得到的抗體是目標抗體[18]。

本研究中，通過細胞融合，雜交瘤篩選，有限稀釋亞克隆，篩選出1株能分泌抗PBA單克隆抗體的雜交瘤細胞株10C2A6，通過體內誘生腹水批量制備出單克隆抗體，亞型為IgG2b型，IC50為0.86 ng/ml，親和力為1.96×109mol/L，除了與1-芘甲醇、1-芘甲醛以及芘交叉反應率分別0.63%，1.42%及1.74%交叉反應率外，與其他物質交叉反應率均小于0.05%。本研究成功制備出了親和力高、靈敏度好、特異性強的PBA-mAb，為其高靈敏免疫學檢測方法的建立奠定了良好的基礎。