scFv親和力對CAR-T細胞抗腫瘤能力的影響①

張代群 李 峰 王淑敏 張 凱 石曉娟 張 毅

(鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心，鄭州大學生命科學學院,鄭州 450052)

嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞已經在血液惡性腫瘤臨床應用中取得了較好的臨床效果[1]。但是，CAR-T細胞在治療實體瘤方面并沒有取得預期的療效，其中CAR-T細胞在應用過程中產生的脫靶效應是主要原因之一[2]。人類表皮生長因子受體2(HER2，也稱為Her-2/neu或ErbB2)是跨膜表皮生長因子受體家族的成員，在多種腫瘤細胞表面呈高水平表達，可被用作CAR-T細胞治療的靶點[3，4]。然而，2010年Morgan等[5]報道了一名ErbB2高表達的結腸癌患者接受ErbB2-CAR-T細胞治療的病例，患者在接受細胞回輸15 min后出現呼吸困難，最終在5 d后死亡，可能是因為患者肺部存在低水平的ErbB2表達，使CAR-T細胞產生脫靶效應，從而攻擊正常的肺部組織。為了消除這種脫靶效應，通過改變單鏈可變區(scFv)降低CAR結合域對靶標的親和力已成為一種流行的策略[6，7]，但是，降低CAR親和力也可能會減弱抗腫瘤功能的效力[8]。因此，關鍵是要確定能夠達到最好的抗腫瘤效果并且不會產生脫靶效應的條件。本課題組應用靶向ErbB2的兩種低親和力的scFv——FRP5(KD=30 nmol/L)和chA21(KD=11 nmol/L)作為CAR的細胞外結合域[9,10]，其中chA21的親和力高于FRP5，通過對比兩種CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用、細胞因子分泌以及形成免疫突觸的能力，證明chA21-CAR-T能夠產生更強的抗腫瘤效應，并且不會產生脫靶效應。

1 材料與方法

1.1材料 MCF-7、MRC-5和293T細胞均購自上海中國科學院細胞所，DMEM高糖培養基、RPMI1640培養基購自Sigma公司(美國)，胎牛血清購自HyClone公司(美國)，青鏈霉素混合溶液購自Gibco公司(美國)，人外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司，Human CD8 microbeads購自美天旎公司(德國)，Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28、Lipofectamine 3000、eBioscienceTMCell Proliferation Dye eFluorTM670購自Thermo Fisher Scientific公司(美國)，ELISA試劑盒和流式細胞術所用熒光抗體均購自Biolegend公司(美國)，重組人白介素2購自北京雙鷺藥業股份有限公司。

1.2方法

1.2.1分離外周血單個核細胞 采集20 ml健康志愿者的外周血于無菌的肝素抗凝采血管中，1 500 r/min 離心10 min后棄上層血漿，將下層細胞轉移至50 ml無菌離心管，加入無菌PBS稀釋至30 ml 后輕晃混勻，另取一個50 ml無菌離心管，加入15 ml外周血淋巴細胞分離液。將稀釋后的血液傾倒于淋巴細胞分離液的液面上。2 500 r/min離心25 min；用無菌移液管吸取中間白膜層至另一無菌50 ml離心管中，加無菌PBS至50 ml，1 500 r/min離心10 min，外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)在沉淀中。

1.2.2分選及培養CD8+T細胞 通過細胞免疫磁珠分選法獲得CD8+T細胞。用磁珠分選緩沖液重懸PBMC，1 500 r/min離心5 min后棄上清。顯微鏡下計數后，每1×107個細胞避光加入20 μl人CD8磁珠和80 μl磁分選緩沖液，混勻后置于4℃避光孵育20 min。1 500 r/min離心5 min后棄上清，加入適量磁分選緩沖液重懸細胞。在磁分選磁場中固定磁分選柱子，用磁分選緩沖液潤洗柱子后緩慢加入細胞懸液，待全部細胞通過柱子后，用磁分選緩沖液清洗柱子2次。將柱子從磁場中取出，用活塞快速加壓將細胞收集至離心管內，離心棄上清，沉淀即為CD8+T細胞。用加了人IL-2重組蛋白的含10%胎牛血清的RPMI1640重懸后，將細胞鋪于12孔板中，同時加入CD3/CD28 beads活化。

1.2.3制備及培養FRP5-CAR-T與chA21-CAR-T細胞 合成FRP5-4-1BB-CAR與chA21-4-1BB-CAR的序列，CAR結構包括CD8α導肽、FRP5或chA21的單鏈可變區序列(scFv)、CD8α鉸鏈區與跨膜區、4-1BB、CD3ζ信號及2A剪切肽(P2A)，并連接綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，將其亞克隆入慢病毒載體中，獲得質粒，測序鑒定正確后，通過轉染293T細胞獲得病毒上清，感染CD8+T細胞獲得CAR-T細胞。

1.2.4流式細胞術檢測轉染效率 收集對照組(UTD)T細胞及CAR-T細胞各1×105個，1 500 r/min離心5 min后棄上清，用PBS清洗后用200 μl的PBS重懸細胞，以UTD組的T細胞為對照，流式細胞術檢測GFP表達效率。

1.2.5血球計數法檢測T細胞增殖能力 將CAR-T細胞各5×106個/孔的初始數量鋪于12孔板中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養，在培養的第3天、第6天、第9天和第12天收取細胞，混勻后吸取10 μl于血球計數板上計數，比較CAR-T細胞的增殖能力。

1.2.6流式細胞術檢測T細胞的分化狀態 收取T細胞1×105個于1.5 ml EP管，避光加入CD8-APC-Cy7、CD45RA-APC、CD62L-PE，4℃孵育20 min后在流式細胞儀檢測。CD45RA+CD62L+為初始T細胞(na?ve T cells，Tn)，CD45RA+CD62L-為效應T細胞(effector T cells,Teff),CD45RA-CD62L+為中心記憶性T細胞(center memory T cells，Tcm)，CD45RA-CD62L-為效應記憶性T細胞(effector memory T cells,Tem)。

1.2.7流式細胞術檢測細胞ErbB2的表達水平 收集MRC-5和MCF-7兩種細胞各1×105個于1.5 ml EP管，Flow buffer洗滌后避光加入流式抗體ErbB2-APC，以同型對照為參考，4℃避光孵育 20 min 后于流式細胞儀檢測。

1.2.8ELISA檢測功能性分子的分泌水平 分別用UTD組T細胞、FRP5-CAR-T細胞、chA21-CAR-T細胞與MRC-5、MCF-7細胞共孵育24 h，1 500 r/min離心5 min后收集上清，用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測上清中T細胞效應分子IL-2、IFN-γ分泌量的差異。

1.2.9CAR-T細胞殺傷能力的檢測 用轉染空載體的T細胞、FRP5-CAR-T細胞和chA21-CAR-T細胞分別與熒光素酶轉基因的MRC-5和MCF-7細胞按照0∶1、1∶1、5∶1和20∶1 的效靶比共孵育24 h后，加入熒光素底物后在活體成像儀下檢測腫瘤細胞的熒光強度變化，以熒光強度代表腫瘤細胞的數量。

1.2.10成像流式細胞儀檢測免疫突觸 腫瘤細胞用eBioscienceTMCell Proliferation Dye eFluorTM670染料，再用F-actin染料分別標記腫瘤細胞和CAR-T細胞，最后將兩種細胞在37℃共孵育30 min，用成像流式細胞儀檢測免疫突觸的形成，用Image J分析形成突觸的熒光強度。

2 結果

2.1構建FRP5-CAR-T和chA21-CAR-T細胞 根據實驗設計，分別構建了靶向ErbB-2抗原的FRP5 4-1BB-CAR(KD=30 nmol/L)[11]和chA21 4-1BB-CAR(KD=11 nmol/L)[12](圖1A)；利用慢病毒轉染的方法，成功構建兩種CAR-T細胞，并通過流式細胞儀檢測轉染效率，FRP5：44.2%，chA21：44.5%(圖1B)；用Fab染色的方法證明CAR分子在細胞表面的表達差異無統計學意義(圖1C)。

2.2檢測CAR-T細胞的增殖能力和分化情況 FRP5-CAR-T細胞及chA21-CAR-T細胞增殖能力和分化情況差異均無統計學意義(圖2A～C)，證明不同親和力的scFv不會對CAR-T細胞的增殖和表型有影響。

2.3CAR-T細胞對ErbB2low細胞和ErbB2hi細胞的殺傷能力 分別檢測人胚肺成纖維細胞MRC-5和腫瘤細胞系MCF-7表達ErbB2的情況，MRC-5為ErbB2low，MCF-7為ErbB2high(圖3A)，統計平均熒光強度發現MRC-5表面ErbB2表達密度遠低于MCF-7(P<0.05，圖3B)。隨后將兩種CAR-T細胞分別與轉入熒光素酶的MRC-5和MCF-7以不同效靶比共孵育24 h，以檢測CAR-T細胞的殺傷能力，當效靶比為5∶1和10∶1時可以看出，chA21-CAR-T細胞的殺傷能力顯著高于FRP5-CAR-T細胞(P<0.05，圖3C～F)，差異具有統計學意義，而且沒有產生脫靶效應。

圖1 CAR-T細胞構建Fig.1 Construction of CAR-T cellsNote:A.Schematics of CAR molecule;B.GFP positive efficiency were detected by FACS day 4 after transduction;C.Fab staining for detection of CAR expression density.

圖2 CAR-T細胞的增殖和分化Fig.2 Proliferation and differentiation of CAR-T cellsNote:A.Expansion curve of CAR-T cells;B,C.Phenotypes of CAR-T cells were detected using CD62L and CD45RA antibodies by FACS.

圖3 scFv親和力對CAR-T細胞抗腫瘤能力的影響Fig.3 Effect of scFv affinity on anti-tumor ability of CAR-T cellsNote:A，B.Detected cell surface ErbB2 expression levels by FACS,data were analyzed by student t test,*.P<0.05 vs MRC-5 group；C-F.Co-culture CAR-T cells with MRC-5 and MCF-7 cells with E∶T=0∶1,1∶1,5∶1,20∶1,and determined antitumor efficiency by IVIS imaging;*.P<0.05 vs UTD group;#.P<0.05 vs FRP5-CAR-T group.

圖4 scFv親和力對CAR-T細胞分泌細胞因子的影響Fig.4 Effect of scFv affinity on secretion of cytokines by CAR-T cellsNote:A，B.Determination of IFN-γ and IL-2 concentrations in co-incubated supernatants.*.P<0.05 vs UTD group;#.P<0.05 vs FRP5-CAR-T group.

圖5 scFv親和力對CAR-T細胞長期抗腫瘤能力的影響Fig.5 Effect of scFv affinity on long-term anti-tumor ability of CAR-T cellsNote:A.Co-culture CAR-T cells with MCF-7 cells with E∶T=1∶1,and determined antitumor efficiency by IVIS imaging；B.Fluorescence intensity chart.*.P<0.05 vs UTD group;#.P<0.05 vs FRP5-CAR-T group.

圖6 scFv親和力對CAR-T細胞形成免疫突觸的影響Fig.6 scFv affects ability of CAR-T cells to form imm-une synapsesNote:A.Co-culture CAR-T cells with MCF-7 cells,and detected immune synapses by imaging flow；B.Statistical analysis of immune synaptic MFI using image J software;*.P<0.05 vs UTD group;#.P<0.05 vs FRP5-CAR-T group.

2.4scFv親和力對CAR-T細胞分泌細胞因子能力的影響 收取CAR-T和腫瘤細胞共孵育的上清，用ELISA方法檢測CAR-T細胞分泌細胞因子的情況，發現chA21-CAR-T細胞比FRP5-CAR-T細胞分泌更多的IL-2和IFN-γ(P<0.05，圖4)。

2.5scFv親和力對CAR-T細胞長期抗腫瘤能力的影響 將CAR-T細胞與腫瘤細胞按1∶1的效靶比以每種細胞1×105個/孔的密度鋪到12孔板中，持續觀察發現，chA21-CAR-T細胞對腫瘤細胞生長的抑制作用明顯強于FRP5-CAR-T細胞(P<0.05,圖5)。

2.6scFv親和力對CAR-T細胞形成免疫突觸的影響 細胞毒性T淋巴細胞(CTL)通過與靶細胞形成免疫突觸并向細胞間隙分泌顆粒酶和疏水性蛋白穿孔素而誘導細胞凋亡[11]。檢測不同親和力scFv對CAR-T細胞形成免疫突觸能力的影響，首先標記腫瘤細胞，再用F-actin對CAR-T細胞和腫瘤細胞分別染色，共孵育后，用成像流式細胞儀檢測形成免疫突觸的情況，結果顯示chA21-CAR-T形成免疫突觸的能力更強(P<0.05,圖6)。

3 討論

由于CAR-T細胞在靶向腫瘤相關抗原時會產生脫靶效應，這很大程度上限制了CAR-T療法在實體瘤中的應用。脫靶效應產生的主要原因是缺少理想靶點[12,13]，因此，調節CAR-T細胞對靶抗原的親和力來避免脫靶效應是一種可行的策略[14]，降低CAR對靶標的親和力會提高CAR-T細胞活化的閾值，避免過度活化從而保持記憶表型[15,16]，使CAR-T細胞能夠長期存活，但同時也會一定程度阻礙抗腫瘤效力[9,10]，因此提高CAR-T治療效率和安全性的關鍵是平衡抗原識別和脫靶效應。

ErbB2是目前研究最多的腫瘤相關抗原之一，本研究成功構建了靶向ErbB2的兩種不同親和力scFv的CAR-T細胞，結果顯示，兩種CAR-T細胞均不會靶向低水平表達靶抗原的正常成纖維細胞，同時，更高親和力的chA21-CAR-T細胞的腫瘤殺傷效果和細胞因子分泌水平更高，且具有更強的長期抗腫瘤能力。

預防CAR-T細胞治療所產生的脫靶效應有很多途徑，如在降低scFv親和力的同時增強細胞內共刺激信號，降低CAR-T細胞活化的閾值，使CAR-T細胞更容易被活化[10]。本課題提出調節scFv親和力使其在抗腫瘤效力與防止脫靶效應之間保持平衡，為CAR-T細胞治療的臨床應用提供新的思路。