NLRC5調節(jié)轉化生長因子-β1誘導的肝星狀細胞活化及逆轉對肝纖維化的影響

張燕，范曉翔，章美武，莊魯輝，毛達峰

肝纖維化是由不同病因引起的持續(xù)性慢性肝損傷的常見結果，在損傷因子的作用下，病情呈動態(tài)進展，可逐漸形成肝硬化進而引起一系列嚴重并發(fā)癥，包括門脈高壓、肝衰竭和肝細胞癌等，并增加患者死亡率［1-2］。目前，早期肝纖維化的治療已成為世界性的重大難題。即使在高效抗病毒治療的時代，大多數(shù)慢性肝病患者也無法獲得根本性治療，肝移植仍然是治療失代償性肝硬化或肝癌的唯一有效方法［3］。因此，開發(fā)有效的抗纖維化藥物來阻止肝硬化進展，甚至逆轉晚期肝纖維化極為迫切。長期以來，肝纖維化被認為是一個不可逆的過程。然而近期研究提示，肝纖維化是可逆的，且其與肝細胞失活緊密相關，即通過細胞衰老、凋亡或激活回到更為靜止的表型［4］。核苷酸結合寡聚化結構域NOD樣受體（NLRs）、Toll樣受體（TLRs）能誘導炎性細胞死亡，參與調節(jié)先天免疫和適應性免疫，在肝細胞失活過程中扮演著重要角色［5］。NLRC5是NLRs家族最主要的成員，在免疫組織或器官如脾臟、肺、胸腺和肝臟中有較強表達，可介導炎癥抑制及抗病毒反應。最近研究表明，NLRC5通過抑制κB抑制蛋白激酶α抗體（IKKα）和κB抑制蛋白激酶β抗體（IKKβ）的磷酸化，負性調節(jié)核因子（NF）-κB信號通路，在肝臟中高度表達［6］。LI等［7］研究顯示，降低RAW264.7小鼠巨噬細胞中NLRC5的表達可有效上調脂多糖促炎反應，包括促進白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF）的分泌。以上研究提示NLRC5是一種重要的負性炎癥途徑調節(jié)因子［8］。然而，關于NLRC5在肝纖維化中的作用還沒有進一步的研究報道。本研究旨在探討NLRC5在轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導的肝星狀細胞（HSC）活化中的作用，并探討其與肝纖維化的關系，以評估其臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 體內實驗

1.1.1 體內實驗建模 2018年3—7月選取24只8周齡雄性C57BL/6小鼠（體質量15～20 g），由寧波市第二醫(yī)院實驗動物中心提供。于24 ℃下適應性喂養(yǎng)1周，12 h晝夜交替，自由飲水及進食。根據(jù)隨機數(shù)字表法分為實驗組、正常對照組和逆轉組，每組8只。取20 ml CCl4（上海展云化工有限公司）與30 ml橄欖油（山東浩中化工科技有限公司）制成40%的CCl4橄欖油注射液。實驗組：實驗開始時，皮下注射40%的CCl4橄欖油注射液0.02 ml/g，每周2次，持續(xù)4周，于第4周最后1次注射后24 h將小鼠處死，取其肝組織。逆轉組：實驗開始時，皮下注射40%的CCl4橄欖油注射液0.02 ml/g，每周2次，持續(xù)4周，然后給予正常飲食至第8周，第8周末處死小鼠，取其肝組織。正常對照組：以同劑量橄欖油進行皮下注射，每周2次，持續(xù)4周，第4周末處死小鼠，取其肝組織。將各組肝組織固定、石蠟包埋以備后續(xù)檢查。通過HE、Masson染色和α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）免疫組化結果評估肝纖維化模型成功與否。

1.1.2 HE染色 處死小鼠后，快速取下新鮮肝臟組織塊，觀察各組大鼠肝臟的形態(tài)及顏色變化。將剖取的肝葉投入10%福爾馬林溶液，使組織、細胞蛋白質變性、凝固。使用梯度酒精逐漸脫去組織水分，再將組織塊置于二甲苯中使組織透明。將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫，后進行包埋。用切片機將包埋好的蠟塊切成5 μm薄片。經(jīng)二甲苯脫蠟，使用梯度酒精水化，采用HE染色（上海歌凡生物科技有限公司）進行處理，顯微鏡下觀察肝細胞變性、壞死及炎性細胞浸潤情況。

1.1.3 Masson染色 小鼠肝組織切片用常規(guī)方法進行脫蠟、水化，Weigert蘇木精液核染5～10 min。水洗后，用1%鹽酸乙醇進行分化并快速水洗；而后麗春紅酸性品紅液染色5～10 min，蒸餾水洗；磷鉬酸水溶液處理5 min，苯胺藍染液染色5 min。經(jīng)冰醋酸水溶液處理，95%乙醇及無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固后，置于顯微鏡下仔細觀察肝臟匯管區(qū)膠原纖維沉積量及程度。染色特點：膠原呈藍色，胞質、肌纖維和紅細胞呈紅色，胞核呈藍褐色。采集圖像，每個樣品選取5個不同的視野拍照。

本研究價值：

NLRC5是免疫反應中重要的調控因子之一，近期研究提示NLRC5參與了多種炎性反應，與肝纖維化的發(fā)生緊密相關，但其在肝纖維化中的表達、作用尚不清楚。本研究分析了NLRC5在小鼠肝組織和LX-2細胞中的表達，以揭示NLRC5與肝纖維化及其逆轉的關系，結果發(fā)現(xiàn)NLRC5在肝纖維化進展及逆轉過程中表達有差異。在肝纖維化、活化肝星狀細胞（HSC）中NLRC5的表達與正常對照組相比明顯增高，而在肝纖維化逆轉或失活的HSC中明顯降低。此外，NLRC5的敲除促進核因子（NF）-κB信號通路的激活，表明NLRC5是一種通過負調控NF-κB激活HSC的促纖維化分子。抑制NLRC5可能是治療肝纖維化的一種有效方法。

1.1.4 α-SMA免疫組化 取石蠟切片，室溫下二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。檸檬酸熱修復15 min后將石蠟切片放入濕盒，用3% H2O2處理10 min以阻斷內源性過氧化物酶活性。PBS清洗，加2%胎牛血清白蛋白（BSA）進一步封固。滴加稀釋（1∶400）的α-SMA一抗（上海茹創(chuàng)生物科技有限公司）于4 ℃下孵育過夜；復溫，PBS洗滌后，將石蠟切片與生物素化的二抗（上海茹創(chuàng)生物科技有限公司）在室溫下孵育60 min。通過DAB染色顯示α-SMA表達情況。蘇木精復染，脫水封固，顯微鏡下觀察纖維化區(qū)域內α-SMA陽性區(qū)域，切片中陽性細胞可被染成棕黃色顆粒，計算陽性細胞面積占總面積的比例。每個石蠟切片取5個視野。

1.1.5 實時熒光定量PCR 檢測小鼠肝組織NLRC5 mRNA水平。

1.1.6 Western blotting法 檢測小鼠肝組織NLRC5、磷酸化抑制蛋白α IκBα（P-IκBα）、IκBα、胞質p65、核p65水平。

1.2 體外實驗

1.2.1 體外實驗建模 采用LX-2細胞株（上海雅吉生物科技有限公司）建立肝纖維化及肝纖維化逆轉的體外實驗模型，以探究NLRC5在疾病進展、逆轉中的作用及可能機制。將LX-2細胞株接種于添加了10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），并在37 ℃、濕度70%～80%、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長密度達到80%～90%時，用2 ml消化液進行消化，傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)的細胞分為三組，建立體外肝纖維化模型及肝纖維化逆轉模型〔TGF-β1是刺激HSC活化和分泌細胞外基質（ECM）作用最強的細胞因子，因此本研究采用TGF-β1刺激LX-2細胞以建立肝纖維化模型；MDI可將活化的HSC恢復為失活的HSC，TGF-β1+MDI作為肝纖維化逆轉模型〕。TGF-β1組：采用重組人TGF-β1（美國PeproTech公司）10 ng/ml處理細胞，繼續(xù)培育28 h；對照組：常規(guī)培養(yǎng)；TGF-β1+MDI組：采用2.5 ng/ml TGF-β1處理細胞后，PBS清洗3次，采用MDI（0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+1 μM地塞米松+167 nM胰島素，美國Sigma公司）處理48 h。建模后檢測各組LX-2細胞α-SMA、Col1α1及其mRNA水平，高于對照組則表示體外肝纖維化模型建立成功；低于TGF-β1組，接近對照組水平則提示體外肝纖維化逆轉模型建立成功。比較三組NLRC5及其mRNA水平。

1.2.2 小干擾RNA（siRNA）轉染 NLRC5的特異性、siRNA的設計與合成由上海恒斐生物科技有限公司協(xié)助完成。對1.2.1中培養(yǎng)的對數(shù)期LX-2細胞進行分組，包括NLRC5-siRNA組、Control-siRNA組及正常細胞組。（1）NLRC5-siRNA組，NLRC5-siRNA正向引物：5'-AAGAACGAGAGACUCUGCCAACUGC dTdT-3'，反向 引 物：5'-GAGAGUUGGCAGAGUCUCUCGUUCUU dTdT-3'。（2）control-siRNA組，NLRC5-siRNA陰 性對照的正向引物：5'-CGUACGCGG AAUACUUCGA-3'；反向引物：5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3'。將對數(shù)生長的LX-2細胞培養(yǎng)24 h，根據(jù)LipofectamineTM 2000（美國Invitrogen公司）說明書，混合稀釋的LipofectamineTM 2000和稀釋的siRNA寡聚物，孵育20 min。將LipofectamineTM 2000-siRNA寡聚物加入培養(yǎng)基中，輕輕晃動以混合均勻。轉染后6 h更換培養(yǎng)基，并以10 ng/ml的濃度添加TGF-β1繼續(xù)培養(yǎng)48 h。（3）正常細胞組為轉染NLRC5-siRNA陰性對照的不添加TGF-β1的正常LX-2細胞。采用Western blotting法及實時熒光定量PCR檢測NLRC5和NLRC5 mRNA。

1.2.3 Western blotting法 采用Western blotting法檢測各組細胞NLRC5、α-SMA、I型膠原α1（Col1α1）、P-IκBα、IκBα、胞質p65、核p65水平。用含1%PMSF的RIPA緩沖液（北京賽百盛基因技術有限公司）在冰上裂解全細胞蛋白，15 000 r/min離心30 min（離心半徑8 cm）收集上清液。根據(jù)說明書，使用核蛋白和胞質蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA試劑盒（北京賽百盛基因技術有限公司）測定蛋白濃度。20 μg蛋白質等體積上樣，通過10% SDS-PAGE分離，并轉移到PVDF膜上。室溫下，用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入稀釋的NLRC5一抗、α-SMA一抗、Col1α1一抗、β-actin一抗、IκBα一抗、P-IκBα一抗、胞質p65一抗、核p65一抗（上海歌凡生物科技有限公司），4 ℃過夜孵育。TBST洗3次，加入稀釋的HRP標記的二抗（美國Santa Cruz公司），室溫下孵育2 h。ECL化學發(fā)光試劑盒（北京賽百盛基因技術有限公司）觀察，Image J軟件分析并計算目的蛋白與內參蛋白之間的灰度比值。

1.2.4 實時熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR檢測各組細胞NLRC5、α-SMA、Col1α1 mRNA的含量。使用Trizol試劑（美國Invitrogen公司）從LX-2細胞中提取總RNA，靜置5 min使其完全溶解，將上清液轉移至離心管后加入200 μl氯仿，混勻后，孵育2～3 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min（離心半徑3 cm），分層取上清液。加入等體積異丙醇，振蕩后12 000 r/min離心10 min（離心半徑3 cm），棄上清液，收集沉淀。用預冷的75%乙醇清洗，室溫下晾干，加入15 μl DEPC溶解，取少量樣品檢測其ODA260/A280值確保其純度。參考反轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）合成cDNA，SYBR Green熒光定量試劑盒（大連寶生物工程有限公司）檢測目的基因。PCR反應體系共25 μl，包含1 μl上下游引物（1 μmol/L）、1 μl cDNA產(chǎn)物、2.5μl Taq 10×Buffer、1μl Taq DNA聚合酶、3 μl dNTP混合液，剩余體積用去離子水補充。設置擴增參數(shù)：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，55.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)。以β-actin為內參基因，分析各樣本Ct值，采用2-ΔΔCt分析目的基因相對表達量。引物序列根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫及Prime 5軟件設計，見表1。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列Table 1 Prime sequence for quantitative real-time PCR

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠肝組織病理檢查結果 大體形態(tài)變化：正常對照組小鼠肝臟色澤紅潤，質地柔軟，邊緣規(guī)則。實驗組小鼠肝臟色澤灰暗、表面粗糙、質地較硬，肝組織總體相對腫脹。逆轉組小鼠肝臟邊緣較規(guī)則，部分變銳，表面較為光滑。HE染色結果：正常對照組小鼠肝細胞索排列整齊，無壞死變性、炎性細胞浸潤現(xiàn)象。實驗組小鼠肝組織存在點狀壞死和再生現(xiàn)象，中央靜脈周圍及匯管區(qū)有炎性細胞浸潤，可見脂肪變性、氣球樣變性，部分肝組織結構不清；逆轉組小鼠可見肝臟恢復紅潤，結構趨于正常（見圖1）。Masson染色結果：正常對照組小鼠肝小葉結構正常、完整，僅匯管區(qū)周圍有少許膠原纖維被染成藍色；與正常對照組相比，實驗組小鼠鏡下可清晰看到圍繞在紅色肝細胞團外的藍色膠原纖維，并大量存在于匯管區(qū)；而逆轉組膠原纖維增生相比實驗組有一定程度的改善（見圖2）。三組α-SMA免疫組化陽性細胞比例比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中實驗組小鼠肝組織中α-SMA陽性細胞比例高于正常對照組和逆轉組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；逆轉組和正常對照組小鼠肝組織中α-SMA陽性細胞比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見圖3）。

2.2 小鼠肝組織中NLRC5、NLRC5 mRNA水平 三組小鼠肝組織中NLRC5、NLRC5 mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中實驗組小鼠肝組織中NLRC5、NLRC5 mRNA水平高于正常對照組、逆轉組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常對照組NLRC5、NLRC5 mRNA水平低于逆轉組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖4、表2）。

2.3 小鼠肝內P-IκBα、IκBα、胞質p65及核p65水平 三組小鼠肝組織P-IκBα、胞質p65、核p65水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組小鼠肝組織P-IκBα、核p65水平高于正常對照組及逆轉組，胞質p65水平低于正常對照組及逆轉組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常對照組P-IκBα、核p65水平低于逆轉組，胞質p65水平高于逆轉組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；三組小鼠IκBα水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見圖5、表3）。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色（×200）Figure 1 HE staining of liver tissue in each group of mice

圖2 各組小鼠肝組織Masson染色（×200）Figure 2 Masson trichrome staining of liver tissue in each group of mice

圖3 各組小鼠肝組織α-SMA免疫組化（×200）Figure 3 Immunohistochemistry of α-SMA in liver tissue of mice in each group

圖4 各組小鼠NLRC5蛋白電泳圖Figure 4 Electrophoresis of NLRC5 protein in each group of mice

表2 各組小鼠NLRC5、NLRC5 mRNA水平比較（±s）Table 2 The expression level of NLRC5，NLRC5 mRNA in each group of mice

表2 各組小鼠NLRC5、NLRC5 mRNA水平比較（±s）Table 2 The expression level of NLRC5，NLRC5 mRNA in each group of mice

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與實驗組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) NLRC5 NLRC5 mRNA正常對照組 8 0.578±0.029 1.000±0.043實驗組 8 1.324±0.077a 1.738±0.087a逆轉組 8 0.633±0.032ab 1.422±0.073ab F值 3.368 3.764 P值 0.035 0.024

圖5 各組小鼠肝組織P-IκBα、IκBα、胞質p65及核p65電泳圖Figure 5 Electrophoresis of P-IκBα，IκBα，cytoplasm p65 and nuclear p65 in mouse liver

2.4 LX-2細胞α-SMA、Col1α1及其mRNA水平三組LX-2細胞α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TGF-β1組LX-2細胞的α-SMA、Col1α1及其mRNA水平均高于對照組、TGF-β1+MDI組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組LX-2細胞的α-SMA、Col1α1及其mRNA水平低于TGF-β1+MDI組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖6、表4）。

表3 各組小鼠肝內IκBα、P-IκBα、胞質p65及核p65水平比較（±s）Table 3 Comparison of the levels of IκBα，P-IκBα，cytoplasmic p65 and nuclear p65 in mice of each group

表3 各組小鼠肝內IκBα、P-IκBα、胞質p65及核p65水平比較（±s）Table 3 Comparison of the levels of IκBα，P-IκBα，cytoplasmic p65 and nuclear p65 in mice of each group

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與實驗組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) P-I κ B α I κ B α 胞質p 6 5 核p 6 5正常對照組 8 0.1 8 2±0.0 0 9 0.4 3 3±0.0 2 6 0.1 7 5±0.0 0 7 0.3 0 1±0.0 1 2實驗組 8 0.3 3 6±0.0 2 0 a 0.4 7 6±0.0 2 9 0.0 9 4±0.0 0 6 a 0.4 8 7±0.0 2 4 a逆轉組 8 0.2 7 4±0.0 1 1 ab 0.4 5 0±0.0 2 3 0.1 2 6±0.0 0 7 ab 0.3 6 3±0.0 2 2 ab F值 3.2 6 1 1.8 0 3 3.1 3 7 4.1 5 7 P值 0.0 3 9 0.1 7 4 0.0 4 4 0.0 1 6

圖6 各組小鼠α-SMA及Col1α1蛋白電泳圖Figure 6 Electrophoresis of α-SMA and Col1α1 protein in each group of mice

2.5 LX-2細胞NLRC5及其mRNA水平 三組LX-2細胞NLRC5及其mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TGF-β1組LX-2細胞中NLRC5及其mRNA水平高于對照組、TGF-β1+MDI組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TGF-β1+MDI組和對照組LX-2細胞中NLRC5及其mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖7、表5）。

表4 各組LX-2細胞α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比較（±s）Table 4 Comparison of α-SMA，Col1α1 and mRNA levels of LX-2 cells in each group

表4 各組LX-2細胞α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比較（±s）Table 4 Comparison of α-SMA，Col1α1 and mRNA levels of LX-2 cells in each group

注：與對照組比較，aP＜0.05；與TGF-β1組比較，bP＜0.05

組別 C o l 1 α 1 α-S M A C o l 1 α 1 m R N A α-S M A m R N A對照組 0.8 2 3±0.0 4 1 0.4 1 0±0.0 2 7 1.1 3 1±0.0 4 5 1.1 5 4±0.0 7 2 T G F-β 1組 1.7 2 5±0.1 2 1 a 1.4 1 6±0.0 8 5 a 1 0.9 2 0±0.5 4 6 a 5.3 5 3±0.2 6 8 a T G F-β 1+M D I組 1.3 9 8±0.0 6 9 ab 0.6 4 5±0.0 3 2 ab 4.4 6 9±0.1 7 8 ab 1.2 0 5±0.0 6 1 a b F值 3.6 4 4 4.8 3 6 1 0.9 7 3 7.6 1 9 P 值 0.0 2 7 0.0 0 9 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1

圖7 各組細胞NLRC5蛋白電泳圖Figure 7 Electrophoresis of NLRC5 protein in each group of cells

表5 各組細胞NLRC5及其mRNA水平（±s）Table 5 The expression level of NLRC5，and NLRC5 mRNA in cells of each group

表5 各組細胞NLRC5及其mRNA水平（±s）Table 5 The expression level of NLRC5，and NLRC5 mRNA in cells of each group

注：與對照組比較，aP＜0.05；與TGF-β1組比較，bP＜0.05

組別 NLRC5 NLRC5 mRNA對照組 1.195±0.060 1.004±0.040 TGF-β1組 2.437±0.122a 1.732±0.087a TGF-β1+MDI組 1.306±0.065ab 1.508±0.075ab F值 3.861 3.256 P值 0.022 0.039

2.6 敲除NLRC5對LX-2細胞中NLRC5表達的影響

NLRC5-siRNA組NLRC5水平（0.679±0.045）低于Control-siRNA組（1.260±0.071），差異有統(tǒng)計學意義（t=11.972，P＜0.001，見圖 8）。

圖8 siRNA轉染后各組細胞NLRC5蛋白的電泳圖Figure 8 Electrophoresis of NLRC5 protein in each group of cells after siRNA transfection

2.7 激活LX-2細胞中α-SMA、Col1α1及其mRNA水平 三組激活LX-2細胞中α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Control-siRNA組、正常細胞組α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NLRC5-siRNA組α-SMA、Col1α1及其mRNA水平低于Control-siRNA組，高于正常細胞組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖9、表6）。

2.8 激活LX-2細胞P-IκBα、IκBα、胞質p65及核p65水平 三組激活LX-2細胞中P-IκBα、胞質p65、核p65水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NLRC5-siRNA組P-IκBα和核p65水平高于正常細胞組和Control-siRNA組，胞質p65低于正常細胞組和Control-siRNA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。三組激活LX-2細胞中IκBα水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見圖10、表7）。

圖9 siRNA轉染后各組細胞α-SMA及Col1α1蛋白的電泳圖Figure 9 Electrophoresis of α-SMA and Col1α1 protein in each group of cells after siRNA transfection

表6 各組激活LX-2細胞中α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比較（±s）Table 6 Comparison of α-SMA，Col1α1 and their mRNA levels in activated LX-2 cells in each group

表6 各組激活LX-2細胞中α-SMA、Col1α1及其mRNA水平比較（±s）Table 6 Comparison of α-SMA，Col1α1 and their mRNA levels in activated LX-2 cells in each group

注：與正常細胞組比較，aP＜0.05；與NLRC5-siRNA組比較，bP＜0.05

組別 Col1α1 α-SMA Col1α1 mRNA α-SMA mRNA正常細胞組 0.780±0.047 0.391±0.022 1.325±0.080 1.243±0.062 NLRC5-siRNA組 1.121±0.056a 0.637±0.034a 6.156±0.308a 2.691±0.135a Control-siRNA 組 1.642±0.082ab 1.326±0.066ab 10.780±0.647ab 5.067±0.203ab F值 5.792 4.268 14.194 11.825 P值 0.004 0.015 ＜0.001 ＜0.001

圖10 siRNA轉染后各組細胞中IκBα、P-IκBα、胞質p65及核p65蛋白的電泳圖Figure 10 Electrophoresis of IκBα，P-IκBα，cytoplasmic p65 and nuclear p65 protein in each group of cells after siRNA transfection

表7 激活LX-2細胞中IκBα、P-IκBα、胞質p65及核p65水平比較（±s）Table 7 Comparison of IκBα，P-IκBα，cytoplasmic p65 and nuclear p65 levels in activated LX-2 cells

表7 激活LX-2細胞中IκBα、P-IκBα、胞質p65及核p65水平比較（±s）Table 7 Comparison of IκBα，P-IκBα，cytoplasmic p65 and nuclear p65 levels in activated LX-2 cells

注：與正常細胞組比較，aP＜0.05；與Control-siRNA組比較，bP＜0.05

組別 P-I κ B α I κ B α 胞質p 6 5 核p 6 5正常細胞組 0.3 7 2±0.0 1 9 1.4 0 3±0.0 8 4 0.4 8 8±0.0 2 4 0.7 3 2±0.3 9 2 C o n t r o l-s i R N A 組 0.8 7 5±0.0 5 3 a 1.4 8 1±0.0 7 4 0.3 1 0±0.0 1 6 a 1.3 6 5±0.0 8 2 a N L R C 5-s i R N A組 1.9 5 5±0.0 9 8 ab 1.3 7 3±0.0 8 2 0.1 9 4±0.0 0 9 ab 1.8 2 6±0.0 9 1 ab F值 6.1 4 1 1.5 1 0 3.3 1 2 8.2 4 9 P值 0.0 0 3 0.2 3 7 0.0 3 7 ＜0.0 0 1

3 討論

肝纖維化是慢性肝損傷常見的病理變化之一，涉及多類分子、細胞、組織，逐漸進展可導致組織學肝硬化或肝細胞癌，甚至肝衰竭。從病理機制來看，肝纖維化主要是由于ECM蛋白在肝實質中的積聚所致［9］。過度的ECM沉積破壞了肝臟的正常結構，導致肝功能紊亂。在此過程中，HSC的活化對肝纖維化的發(fā)生具有重要作用。肝損傷后，HSC被激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞，表達α-SMA并產(chǎn)生ECM，可促進肝纖維化的形成［10-11］。另外，TGF-β1亦在肝纖維化的發(fā)生中起著關鍵作用，其在受影響器官中的表達持續(xù)升高，與ECM沉積增加相關。NLRs在調節(jié)HSC功能如細胞增殖、分化和凋亡中起著至關重要的作用，如JIANG等［12］認為NLRP3炎性體可誘導LX-2細胞中TGF-β1和Col1α1的上調，而在硫代乙酰胺誘導的小鼠纖維化模型中，敲除NLRP3可減少膠原蛋白的形成。以上研究提示NLRs對肝纖維化進展的影響不可忽視，需深入研究。NLRC5作為NLRs家族最主要的成員，包含三個結構域，可以調節(jié)NF-κB信號通路，識別病原體相關的分子模式（PAMPs）并啟動免疫反應。通過調節(jié)JAK2/STAT3信號通路，NLRC5能負作用于細胞因子的分泌。更為重要的是，NLRC5是肝纖維化及其逆轉的關鍵調節(jié)因子，提示其具有一定的臨床應用價值［13］。

許多動物研究及人群研究均表示HSC活化的主要病理生理機制為NF-κB介導的轉錄激活，NF-κB活性增加可誘導各類炎性因子和黏附分子的表達、分泌，而后者參與肝纖維化的形成［14］。在肝內發(fā)生炎癥及膠原沉積期間，核內NF-κB會上調促炎細胞因子表達，包括TNF-α、TGF-β1及白介素，通過激活HSC導致纖維化。為了應對肝損傷，HSC被激活并逐漸產(chǎn)生ECM。該過程有多種生長因子參與，其中最為重要的促纖維化因子即是TGF-β1［15］。LIU等［16］研究結果表明，給予TGF-β1刺激，NF-κB活性增加了2倍左右。CHEN等［17］觀察到TGF-β1誘導的生長停滯反應下降與轉錄因子NF-κB的異常激活有關。HAN等［18］證明TGF-β1對活化HSC細胞凋亡的抑制作用涉及NF-κB蛋白表達。上述發(fā)現(xiàn)提示TGF-β1和NF-κB之間可能存在串擾，但相關機制及NLRC5在此過程中的作用仍有待進一步研究。

本研究分析了小鼠肝組織和LX-2細胞NLRC5的水平，以揭示NLRC5與肝纖維化及其逆轉的關系。本研究結果顯示，實驗組小鼠肝組織NLRC5及其mRNA水平高于正常對照組、逆轉組，體外實驗結果顯示，TGF-β1組LX-2細胞NLRC5及其mRNA水平高于對照組、TGF-β1+MDI組。以上結果提示NLRC5可能在肝纖維化及其逆轉中具有重要作用。在激活的LX-2細胞中使用NLRC5-siRNA后，本研究發(fā)現(xiàn)NLRC5-siRNA組α-SMA、Col1α1及其mRNA水 平 低于ControlsiRNA組，高于正常細胞組，提示NLRC5的抑制可以降低纖維化標志物α-SMA和Col1α1的表達，使活化的HSC向靜止表型的逆轉增加，與相關研究結果一致［19］。

靜息狀態(tài)下，p65亞基與IκB單體結合，位于胞質中，核內缺乏NF-κB。當受到外界刺激時，IκBα發(fā)生磷酸化并降解，p65入核并通過經(jīng)典途徑活化NF-κB。本研究結果顯示，實驗組核p65、P-IκBα及其mRNA水平高于正常對照組及逆轉組，且NLRC5-siRNA組核p65、P-IκBα水平高于正常細胞組和control-siRNA組。可見NLRC5-siRNA處理增加了核內p65、P-IκBα水平，提示NLRC5可能是通過負調控NF-κB參與肝纖維化。由于NLRC5在人類和小鼠以及各種細胞類型中具有保守的生物學功能，因此其可能在維持免疫內穩(wěn)態(tài)，特別是在調節(jié)先天免疫反應方面起著重要的生理作用。但NLRC5與NF-κB信號通路的具體關系及其在多類疾病中的作用仍不夠清晰。根據(jù)本研究結果推測，在LX-2細胞中，NLRC5本身是由NF-κB依賴性機制誘導的；TGF-β1的激活增加了P-IκBα的表達，誘導p65從胞質向胞核轉移，進而促進了HSC中NLRC5的表達，NLRC5與NF-κB相互作用，促進肝纖維化的發(fā)展。本研究局限之處在于，對NF-κB信號通路的研究較淺，相關的細胞因子的探究較少，將在后續(xù)實驗中進一步完善。

總之，NLRC5可調節(jié)TGF-β1誘導的HSC活化和ECM合成，并可以調節(jié)和干擾與肝纖維化相關的關鍵過程，這為臨床治療肝纖維化提供了依據(jù)。

作者貢獻:張燕進行研究設計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；張燕、范曉翔、章美武進行研究實施、評估、資料收集；莊魯輝、毛達峰進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。