益氣化瘀解毒方對(duì)MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因在Sorafenib獲得性耐藥人肝癌QGY7702 細(xì)胞表達(dá)的干預(yù)研究

王亞琪 ，曾普華，郜文輝*，李 為，張 振，周 芳，俞淑嫻

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)腫瘤研究所，長(zhǎng)沙 410006；3.抗腫瘤中藥創(chuàng)制技術(shù)湖南省工程研究中心，長(zhǎng)沙 410006；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410208）

在肝癌（HCC）的臨床治療中，作為一線治療藥物的Sorafenib（索拉非尼）因獲得性耐藥問題而臨床療效欠佳。因此，關(guān)于肝癌靶向藥物Sorafenib 的耐藥機(jī)制及尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的新靶點(diǎn)或藥物，是肝癌相關(guān)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前西醫(yī)治療Sorafenib耐藥尚缺乏特別行之有效的方法。中醫(yī)藥是當(dāng)前臨床治療肝癌的基本手段之一，具有長(zhǎng)期服用且毒副作用低、改善生存質(zhì)量、抗復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢(shì)，且中藥復(fù)方配伍具有“多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)”的整體作用，顯示中醫(yī)藥具有防治肝癌及拮抗耐藥的巨大潛力，因此從傳統(tǒng)中醫(yī)藥尋求逆轉(zhuǎn)Sorafenib 耐藥方藥可望帶來(lái)新的突破[1]。中醫(yī)認(rèn)為瘀、毒、虛與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[2]，三者始終并存，互為因果，惡性循環(huán)，貫穿于肝癌整個(gè)病程。“堅(jiān)者軟之”，“衰者補(bǔ)之”，治療當(dāng)攻補(bǔ)兼施，故潘敏求教授[3]認(rèn)為“益氣化瘀解毒”是切合肝癌病機(jī)的常用治法，以此擬方“益氣化瘀解毒方”。該組方藥物富含人參皂甙、重樓皂苷、多糖、莪術(shù)醇、姜黃素、糖蛋白等多種抗腫瘤活性組分[4]，既往臨床研究[5-6]證實(shí)具有穩(wěn)定瘤體、調(diào)節(jié)免疫、改善生活質(zhì)量、抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而使患者呈現(xiàn)“帶瘤生存”的特點(diǎn)。前期對(duì)其研究[7-11]提示該方可抗肝癌血管新生、抑制血管擬態(tài)形成及EMT 轉(zhuǎn)變，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等抗腫瘤作用。因此，本研究試以探討MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因表達(dá)水平與Sorafenib 獲得性耐藥人肝癌QGY7702 細(xì)胞的耐藥性的相關(guān)性，以臨床效驗(yàn)方“益氣化瘀解毒方”進(jìn)行干預(yù)[6]，旨在明確其對(duì)獲得性耐藥細(xì)胞及相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌QGY7702 細(xì)胞和人肝癌QGY7702/Sorafenib 細(xì)胞均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所劉祖龍博士惠贈(zèng)。高糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清（Gibco）；0.25%胰蛋白酶（Gibco）；青霉素/鏈霉素雙抗溶液（Gibco）；CCK-8 試劑（東仁化學(xué)科技上海有限公司）；DMSO（BioFroxx）；TRIzol ? Reagent（Life Technologies）。Sorafenib（南通飛宇生物科技有限公司，批號(hào)：FY34720409，規(guī)格：200 mg/瓶）。益氣化瘀解毒方（白參10 g，黃芪30 g，醋莪術(shù)15 g，重樓15 g，半枝蓮30 g，甘草5 g 等）飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit試劑盒（Qiagen，貨號(hào)：204054），熒光定量PCR 儀（Roche，貨號(hào)：LC480 Ⅱ）

1.2 方法

1.2.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng) 將人肝癌細(xì)胞株QGY7702或耐藥株QGY7702/Sora 接種于10% 胎牛血清加90%DMEM 加1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液的完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿85%左右時(shí)用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 藥物的配制 1）Sorafenib 儲(chǔ)存液的配制：用20 mL DMSO 溶解200 mg Sorafenib 配制成20 mmol/L濃度儲(chǔ)存液，-20 ℃保存。使用前稀釋至所需工作濃度。2）中藥的煎煮：按比例配置好藥材，加入適量冷水浸泡30 min，文火煎煮，第一道10 倍水煎煮2 h，第二道8 倍水煎煮1 h，兩道混合過(guò)濾、離心去渣，再將藥物濃縮至含1 g 生藥/mL，高壓滅菌后置于4 ℃?zhèn)溆没?20 ℃保存。

1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)藥物IC50 值及對(duì)細(xì)胞增殖影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞用0.25 %胰蛋白酶消化，1 000 r/min，4 ℃，5 min 離心，去上清，用常規(guī)培養(yǎng)基配成細(xì)胞混懸液，濃度約為（6～8）×104/mL，種入96 孔板，每孔100 μL，96 孔板周邊孔以PBS 填充，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培育。在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，用PBS 清洗后，向孔板中加入不同濃度的藥物（Sorafenib 濃度梯度為80、40、20、10、5、2.5 μmol/L；益氣化瘀解毒方濃度梯度為500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/mL），每組設(shè)置5 個(gè)平行孔，繼續(xù)培育24、48、72 h（48 h用PBS清洗后換液）。用PBS 清洗后，每孔加10 μL CCK-8 溶液+100 μL 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 處的吸光度（OD），并計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率，抑制率=[（對(duì)照孔OD-實(shí)驗(yàn)孔OD）/（對(duì)照孔OD-空白孔OD）]×100%。根據(jù)IC50 值計(jì)算耐藥指數(shù)（RI），RI=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè)MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因表達(dá)水平 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的耐藥細(xì)胞以7×105個(gè)/孔的濃度接種于6 孔板，第6 孔接種親本細(xì)胞，24 h 后分別給予Sorafenib 組（8 μmol/L）、益氣化瘀解毒方組（70 mg/mL）、中西聯(lián)合組（Sorafenib 聯(lián)合益氣化瘀解毒方各半），其余耐藥細(xì)胞做模型組，親本細(xì)胞做空白對(duì)照組，給予完全培養(yǎng)基處理，干預(yù)48 h 后，PBS 充分洗滌后，參照Trizol 試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，用熒光定量PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因的表達(dá)量。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延申30 s，40個(gè)循環(huán)。利用QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit 試劑盒(Qiagen，Germany)在LightCycler?480 Ⅱ型熒光定量PCR 儀(Roche，Swiss)上進(jìn)行反應(yīng)，并重復(fù)3 次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計(jì)量資料采用多樣本單因素方差分析及多重分析。

2 結(jié)果

2.1 CCK8 法檢測(cè)QGY7702/Sora 細(xì)胞的耐藥性 CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，QGY7702/Sora 細(xì)胞的Sorafenib IC50值和RI 均明顯高于QGY7702 細(xì)胞，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。RI 約為2.5，屬于低度耐藥。

表1 QGY7702 和QGY7702/Sora 細(xì)胞的Sorafenib IC50 值及RI（）

表1 QGY7702 和QGY7702/Sora 細(xì)胞的Sorafenib IC50 值及RI（）

注：2 組比較，## P ＜0.01

2.2 益氣化瘀解毒方對(duì)耐藥細(xì)胞增殖影響 通過(guò)CCK-8 法檢測(cè)益氣化瘀解毒方對(duì)耐藥細(xì)胞24、48和72 h 后增殖活性，由圖1 增殖曲線可見，益氣化瘀解毒方可抑制QGY7702/Sora 細(xì)胞的增殖活性，且耐藥細(xì)胞的存活率隨濃度與時(shí)間增加而不斷下降，并具一定的劑量和時(shí)間依賴性。中藥 IC50 值為（71.08±4.47） mg/mL。

圖1 益氣化瘀解毒方對(duì)耐藥細(xì)胞增殖影響

2.3 熒光定量PCR 檢測(cè)MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因的表達(dá)水平 通過(guò)熒光定量PCR 對(duì)MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因表達(dá)量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)親本細(xì)胞與耐藥細(xì)胞對(duì)三基因表達(dá)水平并無(wú)顯著異。Sorafenib 組可明顯提高M(jìn)RP、GST-π 的 表達(dá)量（P＜0.01、P＜0.05）；益氣化瘀解毒方組可顯著降低GST-π 的表達(dá)（P＜0.01）；益氣化瘀解毒方聯(lián)合Sorafenib 組可顯著促進(jìn)Topo Ⅱ表達(dá)（P＜0.01）。見表2。

3 討論

肝癌是我國(guó)男性高發(fā)的惡性腫瘤，但目前臨床肝癌在診療過(guò)程存在許多問題導(dǎo)致其預(yù)后差，如早期診斷困難、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、治療缺乏針對(duì)性、源頭創(chuàng)新藥物少、藥物耐藥等問題，其中藥物耐藥性問題是導(dǎo)致臨床肝癌預(yù)后差的重要原因之一。有研究[12]提示，部分三期臨床實(shí)驗(yàn)中僅有2%～3%的肝癌患者對(duì)Sorafenib 治療有療效，大部分患者即表現(xiàn)Sorafenib原發(fā)性耐藥，而且Sorafenib 延長(zhǎng)晚期肝癌患者的生存期也僅有2～3 個(gè)月，之后即表現(xiàn)獲得性耐藥。目前，Sorafenib 原發(fā)性或獲得性耐藥已成為影響患者總體生存期的重要因素。因此，深入探討Sorafenib 耐藥對(duì)于改善肝癌治療及預(yù)后具有重要意義。

表2 各組細(xì)胞MRP、GST-π 和Topo Ⅱ基因的表達(dá)水平

目前多數(shù)研究表明，在體外通過(guò)低濃度持續(xù)誘導(dǎo)法或大劑量間歇誘導(dǎo)法可建立耐藥細(xì)胞株[13-15]。本實(shí)驗(yàn)采用大劑量沖擊法結(jié)合低濃度持續(xù)干預(yù)法誘導(dǎo)建立QGY7702/Sora 耐藥細(xì)胞株[16]，通過(guò)CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞的耐藥性，實(shí)驗(yàn)證實(shí)QGY7702/Sora 細(xì)胞的Sorafenib IC50 值 為（19.651±1.216）μmol/L，RI 為（2.470±0.276），說(shuō)明該細(xì)胞株具有耐藥性，呈低度耐藥。

據(jù)文獻(xiàn)研究提示，目前耐藥被分為典型抗藥機(jī)制和非典型抗藥機(jī)制[17]。其中，多耐藥相關(guān)蛋白（MRP）在典型抗藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topo）在非典型抗藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。MRP 是由COLE 等[18]在1992 年對(duì)耐阿霉素小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H19/AR 的研究中發(fā)現(xiàn)，是分子量為190KD 的ATP 依賴泵型跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要位于細(xì)胞膜。其機(jī)制可能是隨著藥物的使用引起MRP 的過(guò)表達(dá)或者腫瘤自身對(duì)MRP 基因的過(guò)表達(dá)，通過(guò)藥泵的作用將藥物逆濃度差泵出胞外，降低胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生[19-20]。這種藥物外排機(jī)制被稱為經(jīng)典的MDR 機(jī)制，MRP 表達(dá)水平與耐藥程度呈正比。此外有研究提示[21]，MRP 基因在食道癌的表達(dá)量明顯高于其他腫瘤組織，這可能與食道癌化療的原發(fā)性不敏感性有關(guān)。GST[22]是一類與機(jī)體解毒作用有關(guān)的酶類，其中GST-π 是GST 家族中與惡性腫瘤關(guān)系最密切的一種Ⅱ期解毒酶，主要存在于參與機(jī)體解毒、排毒的人體正常組織細(xì)胞的胞質(zhì)中，如呼吸消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等。主要以催化方式降解藥物促進(jìn)其代謝，降低抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒作用而產(chǎn)生耐藥，其表達(dá)高低與腫瘤耐藥性成正比[23]。TopoⅡ[24-25]是機(jī)體內(nèi)重要的核酸酶，參與DNA 的轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制及染色體分離等遺傳過(guò)程，主要存在于S-G2/M 期。主要在核內(nèi)發(fā)揮生理作用，影響DNA的結(jié)構(gòu)和拓?fù)鋵W(xué)，并與期間核基質(zhì)、有絲分裂染色體配對(duì)、染色體分離、基因重組和轉(zhuǎn)錄及DNA 損傷與修復(fù)有密切關(guān)系。Topo Ⅱ含量和或活性的降低與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥密切相關(guān)，與腫瘤耐藥成反比。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，耐藥細(xì)胞MRP、GST-π和Topo Ⅱ基因的表達(dá)水平與親本細(xì)胞無(wú)顯著差異，但兩者對(duì)于Sorafenib 的敏感性有顯著差異，說(shuō)明肝癌細(xì)胞可能存在多種其他耐藥基因的異常表達(dá)或原發(fā)性不敏感性現(xiàn)象，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。Sorafenib可促進(jìn)耐藥細(xì)胞對(duì)MRP、GST-π 表達(dá)，提示肝癌細(xì)胞對(duì)Sorafenib 敏感性降低與MRP、GST-π 基因的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)。MRP 是多耐藥相關(guān)蛋白，與多種化療藥物耐藥相關(guān)。而目前研究提示臨床患者多數(shù)存在Sorafenib 原發(fā)性耐藥，這可能與肝癌患者靶向治療前其他治療相關(guān)。故Sorafenib 獲得性耐藥應(yīng)與GST-π 基因的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)。而益氣化瘀解毒方既可抑制耐藥細(xì)胞增殖活性，亦可抑制GST-π 基因的過(guò)表達(dá)，故益氣化瘀解毒方可拮抗Sorafenib 獲得性耐藥。

綜上所述，肝癌Sorafenib 獲得性耐藥與GST-π基因的過(guò)表達(dá)相關(guān)，而益氣化瘀解毒方可通過(guò)抑制GST-π 基因的過(guò)表達(dá)來(lái)拮抗Sorafenib 獲得性耐藥。同時(shí)，親本細(xì)胞與耐藥細(xì)胞的差異不僅僅局限于比較MRP、GST-π 和Topo Ⅱ，應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)其他蛋白或基因等表達(dá)的差異，精準(zhǔn)治療，指導(dǎo)臨床，針對(duì)性選擇敏感性藥物，個(gè)性化合理用藥，對(duì)改善肝癌預(yù)后具有重要的意義，值得進(jìn)一步研究探討。