穿山龍米曲霉固體發酵物總皂苷的抗腫瘤活性研究

陳航宇 ，劉 鶴，婁婷婷，何 蕊，賀丹彤，劉 睿，位 鴻*

（1.長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021；2.長春中醫藥大學，長春 130117）

穿山龍是我國傳統的中藥材，主要含有多種甾體皂苷類成分，有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[1]，文獻報導從穿山龍中分離的甲基原薯蕷皂苷，具有很強的抗癌活性，是一個開發前景良好的抗癌新藥侯選化合物。

現代發酵技術是在傳統發酵技術的基礎上結合現代生物技術發展起來的新型技術手段。應用現代生物發酵技術在適當的溫度、濕度、水分等條件下對藥物進行發酵，微生物產生的酶，可以使中藥中的化學成分的結構得到修飾，改變其原有的特性，增強或產生新的藥效，擴大應用范圍，以滿足臨床用藥[2]。

本實驗的前期工作，以梗孢科曲霉屬真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）為菌種，采用固體發酵技術，對穿山龍藥材進行發酵研究，經檢測，發酵產物中產生了新的呋甾皂苷，本實驗將穿山龍藥材以及發酵產物進行提取和純化，制成了總皂苷提取物，通過體外細胞實驗，對其抗腫瘤活性及其機制進行研究。

1 材料、試劑及儀器

1.1 主要材料 原材料：穿山龍藥材總皂苷（實驗室自制；紫外分光光度法檢測含量為128.72 mg/g）10 g；穿山龍米曲霉發酵物總皂苷（實驗室自制；紫外分光光度法檢測含量為133.67 mg/g）10 g。

1.2 試劑 MTT 購自Thiazoly 公司；BCA 試劑盒購于碧云天生物制劑公司；Bcl-2、Bax、caspase3、Tublin抗體購于Abcam 公司。

1.3 主要儀器 BT125D 電子分析天平為賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；流式細胞儀（型號Fascs Aria Ⅱ）購于美國BD 公司；酶聯免疫檢測儀（型號Infinit 200 pro）購于瑞士TEC 公司。

1.4 細胞株 人肝腫瘤細胞（HepG2）細胞株，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 方法

2.1 穿山龍皂苷的提取

2.1.1 提取方法 通過前期單因素實驗結果以及綜合文獻[3]，確定了提取穿山龍中皂苷的方法為8 倍量70%乙醇回流提取，每次2 h。

2.1.2 提取工藝 分別稱取穿山龍藥材以及穿山龍米曲霉固體發酵產物100 g，按照2.1.1 項下提取方法進行提取，濃縮至適宜濃度備用。

2.2 穿山龍總皂苷的純化 取穿山龍藥材以及穿山龍米曲霉固體發酵物皂苷提取液用D101 大孔樹脂純化[4]，用75%乙醇洗脫至洗脫液無色，收集洗脫液，減壓濃縮蒸干備用。

2.3 抗腫瘤活性研究

2.3.1 MTT 實驗 將HepG2 細胞接種于96 孔培養板，每組細胞3 復孔，置于恒溫恒濕培養箱培養24 h 后，每孔分別加入濃度為3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL穿山龍總皂苷溶液（穿山龍）和穿山龍米曲霉發酵物總皂苷溶液（發酵物）培養，24 h 后每孔加入10 μL MTT，4 h 后吸去培養基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩混勻30 s，使結晶完全溶解，用酶聯免疫檢測儀于490 nm 波長處測定其吸光度（A）值。對照組細胞存活率設為100%，計算其余各組細胞存活率，細胞存活率=（實驗組平均A 值/對照組平均A 值）×100%。

2.3.2 Annexin V/PI 雙染法 將對數期HepG2 細胞胰酶消化后收集，計數，用完全培養基重懸后，接種于6 孔板。置于恒溫恒濕培養箱培養24 h 后，向每孔分別加入濃度為3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL 穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發酵物總皂苷溶液培養24 h，然后收集細胞重懸于PBS洗滌兩次。用50 μL Annexin V 結合液懸浮細胞，在細胞懸浮液中加入3 μL Annexin V-FITC 染色液，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，加入6 μL PI 染色液后輕輕混勻室溫避光孵育5 min。加入450 μL Annexin V 結合液，終止染色并立即用流式細胞儀檢測，用于檢測細胞凋亡情況。

2.3.3 Western blotting 各組細胞藥物作用24 h 后，用胰酶消化收集細胞，在RIPA 緩沖液中超聲裂解，然后在4℃、10 000 r 下離心15 min，然后用BCA試劑來測定蛋白質濃度。等量的蛋白通過12%的SDS-PAGE 分離并轉移到PVDF 膜上，用5%的脫脂牛奶阻斷1 h 后，加入合適濃度的一抗4℃過夜，一抗分別為Bcl-2、Bax、Caspase3 和內參Tublin，TBST 洗3 次。然后再與標記有辣根過氧化物酶的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，ECL 顯影。利用化學發光系統進行圖像采集及蛋白灰度定量。蛋白表達水平=每個樣本條帶灰度值/Tublin 灰度值。用于測定HepG2 細胞中Bcl-2、Bax、Caspase3 的蛋白表達情況。

3 結果

3.1 MTT 法檢測結果 應用MTT 法對不同濃度的穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發酵物總皂苷溶液培養HepG2細胞，與空白對照組比較，進行細胞活性檢測，結果見圖1，由圖可見，細胞存活率有所下降，且呈現劑量依賴性，即濃度越大細胞存活率越低。

3.2 Annexin V/PI 雙染色結果 鏡下觀察，分別加入不同濃度的穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發酵物總皂苷溶液24 h 后，如圖2 與control 組比較可以看到12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL 濃度細胞明顯死亡，且死亡細胞遞增。50 μg/mL 濃度細胞死亡非常嚴重，更多的細胞變圓，細胞貼壁狀態差，懸浮于培養基。如圖3 進一步根據流式細胞術圖譜可以看出6.25～50 μg/mL不同濃度的穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發酵物總皂苷溶液均可誘導HepG2 細胞凋亡（P＜0.001），凋亡比例明顯呈濃度依賴性的升高。

3.3 Western blotting 結果 通過化學發光系統圖像采集及蛋白灰度定量分析，如圖4，Western blotting 檢測結果顯示，不同濃度的穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發酵物總皂苷溶液處理的HepG2 細胞，與空白對照組比較，Bcl-2、Bax、Caspase3 蛋白表達水平無顯著差異。

圖1 各組細胞存活率比較

圖3 流式細胞術圖譜

圖4 不同濃度的穿山龍總皂苷溶液和穿山龍米曲霉發酵物總皂苷溶液對細胞凋亡相關蛋白表達的影響

4 討論

在本研究中，使用米曲霉對穿山龍藥材進行固體發酵，采用70%乙醇回流法對藥材以及發酵物總皂苷進行提取，D101 樹脂純化，制成了穿山龍總皂苷和穿山龍米曲霉發酵物總皂苷，并采用 MTT 比色法和雙熒光染色法研究其體外抗腫瘤活性，探索發酵對穿山龍藥材抗腫瘤活性的影響。通過體外細胞實驗研究發現，二者均可誘導HepG2 細胞凋亡，凋亡比例明顯呈濃度依賴性的升高，表明發酵物具有同藥材相近的抗腫瘤效果，進一步通過Western blot 對HepG2 細胞蛋白表達情況進行檢測，研究了其抗腫瘤機制。

Bcl-2 家族蛋白在健康和疾病之間調節著細胞生存和死亡的臨界平衡[5-6]，調節線粒體通透性[7]，Bax是bcl-2 蛋白家族中一個促凋亡的成員，它們是使細胞凋亡以及癌癥的治療靶點[8]在活細胞中，bax 和bak(bax/bak)的激活直接受到bcl-2 家族成員的抑制[9]。caspase-3 則是一種主要的凋亡執行者，在大多數凋亡事件中，caspase-3 的高度表達是細胞凋亡的關鍵。

本研究結果表明穿山龍藥材及其米曲霉發酵物對HepG2 細胞具有促進凋亡的作用，其機制可能為上調caspase-3 的表達，對其上游bax 及bcl2 的表達沒有明顯影響，可能藥物誘導HepG2 細胞凋亡不是通過這一通路，具體的抑癌途徑還需要進一步研究，本實驗對有效利用中藥穿山龍資源獲取藥用活性成分并研究其機制提供了前期科學依據。