蜂毒素靶向PTEN/PI3K/Akt 信號通路調控非小細胞肺癌細胞的增殖、凋亡

李玲霞，張英民

（河南科技大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，河南 洛陽 471000）

肺癌是一類世界范圍內常見的呼吸系統惡性腫瘤，其發病率和病死率在惡性腫瘤中都居于首位[1]。非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的一類肺癌類型，占肺癌總發病率的80%左右[2]。肺癌發病前期并無明顯臨床癥狀，因此往往確診時已經是晚期。腫瘤細胞的異常增殖是腫瘤惡化的主要原因，而大部分腫瘤細胞的無限增殖能力是通過死亡逃逸獲得的[3]，因此，尋找安全有效的靶點誘導細胞的凋亡，抑制細胞的增殖成了腫瘤研究的熱點。

蜂毒是蜜蜂工蜂分泌的一種毒液，蜂毒素（Melittin，Mel）是從蜂毒中提取的一種小分子蛋白，具有抗菌、抗病毒及抗炎鎮痛作用[4]，蜂毒素對多種腫瘤細胞有抑制作用，且作用靶點多樣化，包括直接殺傷細胞、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、抑制腫瘤細胞血管生成等方面[5-6]。本研究中，我們探討了蜂毒素對非小細胞肺癌細胞增殖、凋亡的影響，并探討了其可能存在的作用機制，為非小細胞肺癌的臨床治療尋找更安全、有效的治療手段。

1 材料與方法

1.1 實驗用細胞與試劑 人源性非小細胞肺癌系A549 購自中國科學院上海細胞庫；蜂毒素購自上海吉爾公司；含雙抗的RPMI1640 培養基、胎牛血清購自美國Hy Clone 公司，MTT 試劑盒、Annexin V FITC/PI試劑盒購自美國BD 公司；兔抗人PTEN、p-PI3K 多克隆抗體、鼠抗人p-Akt 單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司，p53、CytC 及內參序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，Trizol 購自美國Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 細胞的復蘇與傳代 將凍存的A549 細胞復蘇、重懸于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞鋪滿培養瓶底部70%以上時，將細胞用胰蛋白酶消化、重懸，按1:3 比例進行傳代培養，取傳代后對數期細胞進行后續實驗。

1.3 MTT 檢測細胞增殖活性 取對數期細胞接種于96 孔板，調整細胞密度為每毫升1×106個，按照實驗設計將細胞分為4 組，分別為對照組、Mel 低劑量組、Mel 中劑量組和Mel 高劑量組，依次向各組細胞內加入不同濃度的蜂毒素，調整最終濃度為0、1、2、4 mg/L，每個濃度組設置5 個復孔。將各組細胞分別培養24、48、72 h 后，加入20 μL 的MTT 試劑，培養箱中孵育4 h，離心，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液150 μL，充分震蕩至澄清無結晶，于紫外分光光度計480 nm 波長處測吸光度（OD 值），增殖抑制率（%）=（1-處理組OD/對照組OD 值）×100%。

1.4 Annexin V FITC/PI 聯合流式細胞儀檢測細胞凋亡 將對數期細胞接種至6 孔板，調整細胞密度為每毫升5×105個，每孔內加細胞懸液2 mL，按1.3 所示分組，繼續培養48 h 后，胰蛋白酶消化細胞，預冷PBS 洗滌2 次，離心，將細胞重懸于200 μL Binding Buffer 中，加入5 μLAnnexin V-FITC 混勻，室溫條件下避光反應15 min，繼續加入300 μLBinding Buffer，上流式細胞儀前加入5 μLPI，之后1 h 內上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Western Blot 檢測細胞內PTEN、p-PI3K 和p-Akt蛋白表達 將對數期細胞接種至6 孔板，調整細胞密度為每毫升5×105個，每孔內加細胞懸液2 mL，按1.3所示分組，繼續培養48 h 后，胰蛋白酶消化細胞，二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量，取30 μg 待測樣本蛋白進行10% SDS-PAGE 電泳，轉至硝酸纖維素膜上，加入封閉液搖床孵育2 h，加入稀釋一抗（1:1 000），4 ℃搖床過夜，加入稀釋二抗（1:5 000），常溫孵育2 h，洗膜后暗室中曝光顯影。以內參β-actin為對照，采用Quality One 分析條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與β-actin 比值表示蛋白相對表達量。

1.6 RT-PCR 檢測細胞內p53 和CyclinD1 基因表達 將對數期細胞接種至6 孔板，調整細胞密度為每毫升5×105個，每孔內加細胞懸液2 mL，按1.3 所示分組，繼續培養48 h 后，胰蛋白酶消化細胞，Trizol 提取總RNA，異丙醇處理后收集RNA 沉淀，75%乙醇洗滌，離心，棄上清液，DEPC 水溶解RNA。根據逆轉錄試劑盒說明，以β-actin 為內參進行PCR 擴增，反應條件：95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環；72 ℃總延伸6 min。取5 μL PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，進行灰度掃描分析，比較目的基因與β-actin 條帶灰度之比。引物序列：p53 上游引物：5’-TCGGATTCGGATCGATCGGC-3；下游引物：5’-GCTTAGCTTTCGATCGGATC-3’；CyclinD1 上游引物：5’-TAGCTTTGCTAGCCTACGAT-3；下游引物：5’-TAGCTATTGCTAGGGGCTTA-3’；GAPDH 上 游引物：5’-TAGCTTTAGCTAGGGCTTAG-3；下游引物：5’-TAGCTTTAGCTAGCTTTAGC-3’。

1.7 統計分析 用SPSS19.0 軟件進行統計分析；計量資料以均數±標準差（）表示，多組計量資料間的比較用ANOVA檢驗，組內兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 實驗結果

2.1 蜂毒素對A546 細胞增殖活性的影響 MTT 實驗結果顯示，與對照組相比，各個時間點的蜂毒素處理組細胞的增值抑制率顯著增加（P＜0.05），且抑制效果與藥物濃度呈正相關；Melittin 低劑量組24 h 和48 h 間抑制率無顯著性差異（P＞0.05），而72 h 抑制率顯著高于24 h（P＜0.05），同時，中劑量和高劑量組的抑制效果隨著培養時間的延長而增加，呈時間依賴性（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 各組A549 細胞增殖抑制率

2.2 蜂毒素對A546 細胞凋亡的影響 蜂毒素作用組細胞凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05），且隨著藥物濃度的增加，凋亡率隨之增加（P＜0.05），各藥物濃度組間存在顯著性差異（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 各組細胞凋亡率

2.3 蜂毒素對A546 細胞PTEN、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達的影響 蜂毒素作用組細胞PTEN 的蛋白表達量顯著高于對照組（P＜0.05），而p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達量顯著低于對照組（P＜0.05），同時，隨著藥物濃度的增加，蜂毒素對PTEN 表達的誘導作用和對p-PI3K 和p-Akt 的抑制作用隨之增加，各藥物劑量組之間存在顯著性差異（P＜0.05）（見圖3，表1）。

圖3 各組細胞PTEN、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達

表1 各組細胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達（，n=5）

表1 各組細胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達（，n=5）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與Mel 低劑量組比較，△P ＜0.05；與Mel 中劑量組比較，▲P ＜0.05

2.4 蜂毒素對A546 細胞p53 和CyclinD1 mRNA 表達的影響 蜂毒素作用組細胞內p53 mRNA 的表達顯著高于對照組（P＜0.05），隨著藥物濃度的增加，表達量遞增（P＜0.05）；蜂毒素作用組細胞內CyclinD1 mRNA 的表達顯著弱于對照組（P＜0.05），隨著藥物濃度的增加而遞減（P＜0.05）（見表2）。

表2 各組細胞p53 和CyclinD1 mRNA 表達水平比較（，n=5）

表2 各組細胞p53 和CyclinD1 mRNA 表達水平比較（，n=5）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與Mel 低劑量組比較，△P ＜0.05；與Mel 中劑量組比較，▲P ＜0.05

3 討論

蜂毒素是從蜂毒中提取出來的活性物質，具有多種生物學功能，其抗腫瘤作用已在多種腫瘤細胞中得到證實，蜂毒素能抑制多種腫瘤細胞的增殖，同時促進腫瘤細胞的凋亡[5-9]。本研究中，我們檢測了不同濃度蜂毒素對非小細胞肺癌細胞A549 增殖、凋亡的影響，結果顯示，低劑量蜂毒素即能有效抑制其增殖活性，這種作用隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而加強，同時，蜂毒素能顯著促進A549 細胞的凋亡，這種抑制作用呈現劑量依賴性。以上實驗結果表明，蜂毒素對非小細胞肺癌細胞有生長抑制作用，為了進一步了解蜂毒素對A549 細胞的作用機制，我們進一步探討了其對A549 細胞中PTEN/PI3K/Akt 通路相關分子表達的影響。

人第10 號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物（Gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN）是目前已知的能抑制腫瘤活性的磷酸酶[10]，磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/絲氨酸—蘇氨酸激酶（Protein kinase B,Akt）信號通路在腫瘤細胞信號轉導中起重要作用，其異常活能促進細胞增殖并抑制細胞的凋亡[11]。有研究證實，在腫瘤細胞中，PTEN 通過其脂質磷酸酶活性作用于PI3K/Akt 通路，阻斷該通路活性從而發揮抑癌作用[12]。在肺癌細胞的一項研究中發現，PI3K 抑制劑GSK2636771 能抑制PTEN 表達缺失的肺癌細胞株的增殖并促進細胞的凋亡，將載有PTEN 基因的質粒導入細胞后，PI3K 抑制劑對肺癌細胞增殖、凋亡的影響增強，說明該通路在肺癌細胞的增殖、凋亡過程中發揮重要作用[13]。有報道稱，蜂毒素能上調HepG2 肝癌細胞中PTEN 并抑制下游Akt 通路的激活，從而促進肝癌細胞的凋亡，抑制其增殖[14]。基于以上理論，本研究中，我們探討了蜂毒素對A549 細胞中PTEN/PI3K/Akt 通路中相關分子表達的影響，結果顯示，蜂毒素能刺激A549 細胞中PTEN 的表達，同時抑制PI3K 和Akt的磷酸化，且這種作用隨著藥物劑量的增加而加強，說明蜂毒素能有效調控A549 細胞內PTEN/PI3K/Akt 通路的活性。

為了進一步探討蜂毒素對A549 細胞的作用機制，我們檢測了蜂毒素對PTEN/PI3K/Akt 通路兩個重要的下游因子的作用。p53 是PI3K/Akt 信號通路的一個下游抑癌基因，p53 被活化后能通過上調Caspase-3 和Caspase-9 而誘導細胞凋亡，PI3k/Akt 通路的活化能引起p53的降解，從而影響細胞凋亡[15]，同時有研究證實，p53 介導的腫瘤細胞凋亡在肺癌細胞的發生過程中發揮重要作用[16]。cyclinD1 是PI3K/Akt 通路的另一下游分子，其過表達時能導致細胞異常增殖，細胞周期發生異常變化，對肺癌細胞的增殖起到重要作用[17]。本研究中我們發現，蜂毒素能誘導A549 細胞中p53 蛋白的表達，而抑制cyclinD1 的表達，且這種作用呈劑量依賴性，說明蜂毒素可能時通過抑制PTEN/PI3K/Akt的活性，從而刺激p53 的表達，抑制cyclinD1 的表達而對A549 細胞發揮作用的。

綜上所述，蜂毒素能抑制A549 細胞的增殖，促進其凋亡，這種作用可能是通過調控PTEN/PI3K/Akt信號通路相關分子的表達而實現的。