吳茱萸不同提取部位致大鼠肝毒性研究

任曉靜，李 明，張 遜，馮 昊，袁金斌

（1.唐山市協和醫院藥劑科，河北 唐山 063000；2.唐山市人民醫院藥劑科，河北 唐山 063000；3.江西中醫藥大學，南昌 330004）

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石 虎E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛吳茱萸Euodia Rutaecarpa （Juss.）Benth.var.bodinier（Dode）Huang 的干燥近成熟果實[1]。現代研究表明吳茱萸具有鎮痛[2-3]、止嘔[4-5]、抗炎、抗癌、抗增殖、抗感染、抗細菌等多種生物活性[6-7]，歷代文獻和2015年版《中國藥典》（一部）均記載吳茱萸“小毒”或“有毒”，吳茱萸的主要成分為吳茱萸堿、吳茱萸次堿、和檸檬苦素等[4-6]。李文蘭等[8]研究表明，吳茱萸喹諾酮類生物堿為肝毒性主要成分，對小鼠給藥后，血清肝功能指標和肝臟指數升高，肝臟中央靜脈及小葉下靜脈周圍肝細胞變形、灶性壞死，表明吳茱萸喹諾酮類生物堿毒性作用于肝臟。已有研究報道了吳茱萸水提物的肝毒性[9-10]、乙醇提取物的急性毒性和肝毒性作用[11]，本文對吳茱萸石油醚提取部位、正丁醇提取部位、水提取部位、氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位同時進行大鼠肝毒性研究，確定各提取部位的毒性強度，為進一步研究吳茱萸的毒性成分提供了依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 分析天平（AE-240，北京賽多利斯儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（RE-52A，上海亞榮生化儀器廠）；高速冷凍離心機（SIGMA 公司）；AU480全自動生化分析儀（Beckman Coulter，USA）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機（SIGMA-18，SIGMA 公司，德國）。

1.2 試藥 吳茱萸藥材采集于江西新干縣淦川鎮，經江西中醫藥大學楊武亮教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa (Juss.) Benth.的干燥近成熟果實；丙氨酸氨基轉移酶（ALT，批號：20150418）、天門冬氨酸轉移酶（AST，批號：20150418），購于南昌百特生物高新技術股份有限公司；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純（西隴化工）；水為重蒸餾水。

1.3 實驗動物 健康SD 大鼠，體質量為180～220 g，清潔級，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。飼養溫度（22±2）℃，自然照明，正常飼養。

2 方法

2.1 吳茱萸不同提取物浸膏制備 采用加熱回流提取法，選取一定量吳茱萸藥材，經烘干、粉碎，過三號篩備用，稱取2.5 kg 吳茱萸藥材粉末，加入20 L75%乙醇，加熱回流1.5 h，按此方案再提取1次，時間1.0 h，將2 次提取液過濾，合并。剩余的殘渣用10 倍量蒸餾水煎煮1.0 h，收集上層溶液后繼續用蒸餾水煎煮0.5 h，水提取物合并過濾。乙醇萃取液經真空蒸餾后回收至無乙醇氣味，并與水提液混合，濃縮干燥后得到吳茱萸浸膏，再用蒸餾水稀釋，最后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，重復3～5 次，將各溶劑萃取液合并一起，得到5 種不同的提取部位溶液，回流濃縮萃取液，冷凍干燥，得5種不同提取部位浸膏，密封放置冰箱中保存，以備不同提取部位的毒性實驗用。

2.2 動物分組與給藥 隨機挑選SD 大鼠160 只，雌雄各半，按隨機分配法分為正常組1 組，實驗組5 組，每組10 只，實驗組包括石油醚提取部位、氯仿提取部位、乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位以及水提取部位的低、中、高3 個劑量組。以吳茱萸臨床常用劑量為依據，按成人（60 kg）處方日用量（10 g）的臨床等效量的1、2、4 倍設計，設定高、中、低劑量分別為3.46、1.73、0.87 g/kg，均按25 mL/kg 計算給藥體積，給藥組每天按時給予一定劑量的藥物，對照組給予等體積的蒸餾水。實驗期間主要觀察大鼠的活動情況，毛色變化以及飲食情況，并記錄。

2.3 生化指標檢測 最后1 次給藥前12 h 禁食，正常飲水，各劑量組大鼠灌胃給藥，2 h 后取大鼠眼球靜脈血，靜置30 min 后離心，取上層血清，按相關試劑盒說明書要求進行檢測，測定ALT、AST 活性。

2.4 組織病理學檢查 大鼠取血后立即解剖大鼠，取大鼠肝臟，將周圍結締組織剔除后放入生理鹽水中漂洗，然后用濾紙拭干表面液體，稱重并計算其肝臟指數（肝臟系數=肝臟質量/體質量）×100%；另取肝臟右葉，以10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，用常規HE染色，光學顯微鏡下觀察其組織形態學變化。

2.5 數據處理 用SPSS 17.0 統計軟件對各參數進行單因素方差分析。

3 結果

3.1 一般情況觀察 實驗7 d 內，對照組大鼠活動正常、毛色光亮、飲水飲食均正常，無死亡。觀察吳茱萸不同提取部位各劑量組大鼠，癥狀主要表現為腹瀉、不活潑，毛色暗淡，進食飲水不良。稱量大鼠體質量，各劑量組大鼠生長緩慢，同對照組比較，給藥7 d 后乙酸乙酯、正丁醇各劑量組和水部位高劑量出現統計學差異。大鼠體質量信息見表1。

3.2 對大鼠血清生化指標的影響 對照組大鼠血清AST、ALT 數值均處于正常范圍內。而吳茱萸不同提取部位的各劑量組血清AST、ALT 內水平均顯著升高，與對照組數據相比較，具有統計學差異（P＜0.05，P＜0.01），其中石油醚提取部位高、中、低劑量組的AST、ALT 水平提高最為顯著，其次依次為正丁醇提取部位、水提取部位、氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位，結果見表2。

表1 吳茱萸不同提取部位對大鼠體質量變化的影響（，n=10）

表1 吳茱萸不同提取部位對大鼠體質量變化的影響（，n=10）

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 吳茱萸不同提取部位對大鼠血清生化指標的影響（，n=10）

表2 吳茱萸不同提取部位對大鼠血清生化指標的影響（，n=10）

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.3 吳茱萸不同提取部位肝臟器指數檢測 吳茱萸不同提取部位各劑量組均可導致肝/體比值增加，除石油醚低劑量組、氯仿低劑量組和正丁醇低劑量組外，其余各劑量組與對照組比較，呈現極顯著性差異和顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），且隨著劑量增大，肝/體比值逐漸增加，呈現一定的劑量依賴關系，結果見表3。

表3 吳茱萸不同提取部位對大鼠肝臟器指數的影響（，n=10）

表3 吳茱萸不同提取部位對大鼠肝臟器指數的影響（，n=10）

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.4 對大鼠肝臟病理學影響 光鏡下組織病理學檢查發現，對照組肝臟無異常，肝小葉結構清晰完好，肝細胞未見明顯變性、壞死，肝竇未見明顯瘀血擴張，實驗組中吳茱萸不同提取部位低、中劑量組的大鼠肝臟損傷未見明顯異常，而高劑量組的大鼠肝臟出現不同程度損傷，主要表現為肝細胞腫脹，且有少部分可見小灶性或單細胞壞死，壞死細胞彌漫性存在于肝小葉中央，伴炎癥細胞浸潤，結果見圖1。

圖1 大鼠肝臟病理學切片結果

4 討論

肝臟作為動物體重要的代謝器官，承擔著機體重要的生理功能。容易受到外界因素的入侵而受損，肝臟的損傷主要分為暴力性肝損傷（如物理性損傷）和病理性損傷（包括化學性、藥物性及酒精性肝損傷等），臨床上血清中ALT、AST 的水平是檢查肝損傷程度的重要指標。

本實驗對吳茱萸不同提取部位均進行了肝毒性研究，以臨床劑量下給大鼠灌服吳茱萸不同極性提取物，以ALT、AST 水平來衡量大鼠肝損傷大小，經過數據分析后對吳茱萸的肝毒性進行評價，通過對大鼠肝臟器指數的分析，結合肝臟切片的組織病理學檢查，來評價吳茱萸各提取物對大鼠肝臟的損傷。生化指標結果得出，吳茱萸不同溶劑提取部位都顯示有肝毒性，5個不同提取部位對大鼠肝毒性強度為：石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位＞氯仿部位＞乙酸乙酯部位。肝臟組織病理學檢查結果發現高劑量組的大鼠肝臟出現不同程度損傷，主要表現為肝細胞腫脹，且有少部分可見小灶性或單細胞壞死，壞死細胞彌漫性存在于肝小葉中央，伴炎癥細胞浸潤，說明吳茱萸具有肝毒性。

吳茱萸主要化學成分為生物堿類物質、檸檬苦素類物質和揮發油類物質。有研究表明[8]，吳茱萸中喹諾酮類生物堿為主要肝毒性物質，由于石油醚提取物中喹諾酮生物堿含量較高，所以實驗驗證了石油醚提取部位肝毒性最強。臨床上吳茱萸多以水煎液為藥用劑型，用量因毒性受到限制，所以確定吳茱萸水提部位也具有毒性。吳茱萸毒性成分種類不明確，且各成分的毒性強度又有所不同，體現出吳茱萸各提取物均具有一定毒性。本實驗通過對吳茱萸不同提取部位肝毒性考察，提供了吳茱萸肝毒性物質的基本信息，從而能進一步探求吳茱萸毒性成分，為吳茱萸中醫臨床安全有效用藥提供科學依據，為同類有毒中藥物質基礎研究提供了思路。