APMP廢液中半纖維素的羧甲基化及生物活性研究*

陳 婷，劉海棠,2,3，劉 婧，李 潔，安永貞，張曉晨

(1. 中國輕工業造紙與生物質精煉重點實驗室，天津市制漿造紙重點實驗室，天津科技大學，天津 300457；2. 江蘇省生物質能源與材料重點實驗室, 南京 210042；3. 天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津科技大學，天津 300457)

0 引 言

近年來隨著綠色生態觀念不斷深入人心，生態工業也逐漸符合當今21世紀的綠色發展理念，隨著生物質精煉的提出，越來越多的研究者開始重視生物質原料和造紙廢液的綜合利用與開發，不僅可以替代化石基材料，而且可以改善傳統利用方式的低效率、高污染的缺點[1-2]。

在造紙工業中最為矚目的APMP法制漿工藝，即堿性過氧化氫化學機械法[3]，具有高得率、紙漿強度好、低污染、低能耗等突出優點，但大量半纖維素在各個工藝階段被逐步帶入廢液中[4]。因此對APMP廢液中的半纖維素等生物質資源進行回收利用，不僅能提高企業的效益，還符合現代生態工業的發展理念。

半纖維素是由幾種不同類型的單糖構成的異質多聚體。近年來，研究者在半纖維素轉化為糖[5]，化學品，燃料[6]等方面，展現了廣闊的應用前景。半纖維素沿骨架和側鏈上分布的大量游離的羥基與低分子醇類的化學性質相似，可與酸反應生成酯類，與烷基化試劑反應生成醚類，酯化[7]與醚化[8]是最為重要的半纖維素衍生反應。宋飛宇等采用醚化法制備了具有較高羧基含量、較高分子量的羧甲基半纖維素[9]，并將其與聚酰胺多胺-表氯醇樹脂類濕強劑聯用以提高紙張的濕抗張強度。曾月[10]等制備了對Cu2+有良好吸附性能的羧甲基半纖維素/殼聚糖復合材料。有研究表明，多糖在羧甲基化之后具備良好的生物活性。別蒙[11]等以一氯乙酸為羧甲基化試劑合成的羧甲基茯苓多糖具有良好的抑菌活性。馮燕茹[12]等對羧甲基茯苓多糖進行體外抗氧化性實驗，結果表明，改性后的茯苓多糖具有Fe3+的還原能力和對羥自由基的清除能力。這些研究成果結合半纖維素自身具有的生物相容性和生物可降解性，為羧甲基半纖維素的生物活性探究以及在生物醫藥和化妝品領域的應用提供了理論基礎。

本文主要是從桉木APMP廢液中提取半纖維素，將其進行羧甲基化改性，并對改性前后的半纖維素進行生物活性探究，主要是抗氧化性，吸濕、保濕性和抑菌性。

1 實 驗

1.1 儀器與材料

桉木APMP制漿廢液(山東造紙廠)，無水乙醇，氯乙酸，氫氧化鈉，硫酸亞鐵，過氧化氫，水楊酸，濃硫酸，硫酸銨，碳酸鈉，溴化鉀，枯草芽孢桿菌，沙門氏桿菌，酵母浸粉，牛肉膏，蛋白胨。

傅里葉紅外光譜儀(FT-IR 650，天津港東科技發展股份有限公司)，高效液相色譜儀(1200，美國Agilent)，紫外分光光度計(T6，北京普析儀器有限責任公司)，超凈工作臺。

1.2 半纖維素的提取

APMP廢液中提取半纖維素主要分為兩部分：(1)木素的分離：取一定量濃縮后的廢液于燒杯中，緩慢滴加濃硫酸(w%=72%)，調pH為1.7；再將其置于恒溫水浴鍋中加熱(45 ℃，30 min)，有沉淀生成；待廢液冷卻至室溫后將底部褐色沉淀(主要成分為木素)除去，留濾液備用。

圖1 APMP廢液中提取半纖維素的流程圖Fig 1 A flow chart for extracting hemicellulose from APMP waste liquor

(2)醇沉法提半纖維素：向濾液中緩慢滴加6 mol/L的氫氧化鈉溶液，調 pH至4；再加入無水乙醇(V濾液∶V無水乙醇=1∶4)，有淡黃色絮狀物質出現，靜置24 h；24 h后懸浮液明顯分層，底部為淡黃色固體，除去上層溶液后對底部沉淀進行2～3次洗滌(85%乙醇)，并放于真空干燥箱中干燥(40 ℃，24 h)；干燥后的粉末即半纖維素(HC)。

1.3 羧甲基半纖維素的合成

稱一定量的半纖維素(HC)加入到50 mL的三頸燒瓶中，在30 ℃下加水溶解，在加入50%的NaOH，攪拌20 min后加入無水乙醇(V無水乙醇∶V水=4∶1)；繼續加入一定量的ClCH2COOH，溫度升至75 ℃，再加入剩余的NaOH，反應2 h；結束后將上清液除去，殘渣用85%乙醇進行多次洗滌，真空干燥12 h，所得物質為羧甲基半纖維素(CMHC)。

取代度的測定：0.2 g的CMHC充分溶解于50 mL的蒸餾水中，用酸或堿溶液調節pH至8.0，再用0.05 mol/L的硫酸標準溶液進行滴定，至溶液pH為3.74為止，記錄所用硫酸標準溶液的體積V。

按照公式(1)計算CMHC的取代度(DS)

DS=0.132B/(1-0.08B)

B=2MV/m

式中，m為CMHC的質量，g;M為硫酸標準溶液的摩爾濃度，mol/L;V是滴定所用的硫酸標準溶液的體積，mL。

1.4 性能與表征

1.4.1 紅外光譜(FT-IR)測定

將HC，CMHC和溴化鉀(KBr)在105 ℃進行烘干4 h。少量待測樣(HC，CMHC)分別和KBr以m(待測樣)/m(KBr)=1∶100的比例進行充分研磨，壓片制樣，壓力為10 MPa，時間60 s，掃描范圍400～4 000 cm-1,分辨率4 cm-1。

1.4.2 抗氧化性測定

采用測定羥基自由基清除率的方法對HC和CMHC進行抗氧化性評價。

稱取50 mg樣品充分溶于8 mL蒸餾水中，配成母液，待用。取兩組試管，編號為A-(1～6)和B-(1～6)，設置一個空白樣。分別往A-1和B-1號試管中加入2 mL母液，再逐級稀釋，加完兩組試管；向A組試管中依次加入2 mL的2 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和2 mmol/L水楊酸溶液，充分搖勻，靜置10 min；再加入2 mL 的6 mmol/L過氧化氫溶液，混勻后置于37 ℃的恒溫水浴鍋中加熱30 min；使用紫外可見分光光度計測出A組在510 nm處的吸光度A1；同樣方法，用2 mL蒸餾水代替樣液，其他步驟不變，測定空白樣在510 nm處吸光度A0；B組試管中加入的過氧化氫溶液使用等體積蒸餾水代替，其他操作不變，測定吸光度A2。

根據公式(2)計算羥基自由基清除率：

1.4.3 吸濕、保濕性測定

在室溫下，精確稱取0.5 g樣品各兩份，放入稱量瓶中。準備兩個干燥器，一個放有飽和的硫酸銨溶液(RH=81%)，另一個放有飽和的碳酸鈉溶液(RH=43%)，將樣品分別放置其中，12、24、48、72 h時分別稱其質量。記錄樣品放置前的質量(記作X)樣品放置后的質量(記作Y)。

根據公式(3)計算吸濕率：

在室溫下，精確稱取0.5 g樣品各兩份，將稱量好的樣品分別放入稱量瓶中,用滴管向其滴加去離子水(樣品質量10%左右)，質量記為Y。將其分別放在兩個干燥器中,一個放有飽和的碳酸鈉溶液(RH=43%),另一個放置干硅膠，在12、24、48、72 h時分別稱其質量X。

根據公式(4)計算保濕率：

1.4.4 抑菌性測定

采用牛津杯法分別測定HC和CMHC的體外抑菌活性。實驗所用菌種是沙門氏菌和枯草芽孢桿菌，實驗室自培。待測樣品用蒸餾水將其分別配制成濃度為20 mg/mL的溶液；按實驗標準方法依次進行滅菌、倒板、涂抹菌液、倒入樣液和培養等步驟，并拍照、記錄抑菌圈直徑。

2 結果與討論

2.1 半纖維素組分含量分析

表1為APMP廢液中提取的半纖維素通過兩步酸水解后用HPLC測定的單糖組分含量，結果顯示該半纖維素水解產物由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖組成，其中木糖含量最高為 68.52%，其次為葡萄糖28.84%，阿拉伯糖含量較低為2.64%可以得出，APMP廢液中提取的半纖維素的主要成分是木聚糖。

表1APMP廢液中半纖維素的單糖組分含量

Table1ThemonosaccharidecontentofhemicelluloseextractedfromeucalyptusAPMPwasteliquor

2.2 羧甲基半纖維素的合成

2.2.1 羧甲基半纖維素的反應機理：

(1)堿化反應

半纖維素在堿性環境中，糖單元的羥基被堿化成氧負離子，提高了親核性，另外，半纖維素在堿性條件下充分潤脹甚至溶解，有助于醚化劑的滲透，一定程度上提高了后續醚化反應的效率和均一性。

(2)醚化反應

在堿性環境中，氯乙酸的α-C從背面進攻半纖維素鏈上的氧負離子，發生了SN2雙分子親核取代反應，并生成羧甲基半纖維素鈉[9]。

圖2 羧甲基半纖維素(CMHC)的反應機理Fig 2 Reaction mechanism of carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

2.2.2 羧甲基半纖維素(CMHC)的取代度

圖3-a中表示溫度在75 ℃時，是合成CMHC的最佳溫度，此溫度下DS最大，為1.48；圖3-b是在75 ℃時，NaOH的用量對DS的影響，在NaOH/HC(mol/mol)為1時，DS最大，為1.47，NaOH的量過少時，半纖維素的親核性過低，NaOH用量過多時，副反應被促進，都不利于反應進行；圖3-c是在最佳溫度和NaOH用量時，醚化劑(ClCH2COOH)的用量對DS的影響，圖中可以看出，隨著ClCH2COOH用量的增加，醚化反應更加充分，DS也逐漸提高，但是，當ClCH2COOH/HC(mol/mol)為3時，會中和堿化過程中全部的堿，使后續的醚化反應體系呈弱酸性，破壞醚化反應所需的弱堿性條件，因而不利于CMHC的合成。以下表征是選用CMHC-12和HC進行對比分析。

2.3 性能與表征

2.3.1 紅外光譜分析

從圖4-a HC的FT-IR圖中可以看出，1 129cm-1，619 cm-1是糖單元上醚鍵(C-O-C)的吸收峰，是木聚糖的特征峰，2 918 cm-1是 -CH2- 的吸收峰，說明APMP廢液的乙醇沉淀物是以木聚糖為主要成分的半纖維素。從圖4-b CMHC的FT-IR圖中可以看出，1597 cm-1附近是羧基(-COOH)的(C=O)非對稱振動吸收，1420cm-1附近是與羧基相連的甲基(-CH3)的(C-H)振動吸收、1 320 cm-1附近的(C=O)對稱伸縮吸收增強，表明樣品中羧甲基(-OCH2-COOH)的存在，即半纖維素成功被羧甲基化。

圖3 溫度、堿用量和醚化劑用量對羧甲基半纖維素(CMHC)取代度(DS)的影響Fig 3 Effect of different temperature, amount of alkali and amount of etherifying agent on the degree of substitution of carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

圖4 半纖維素(HC)和羧甲基半纖維素(CMHC)的紅外光譜圖Fig 4 FT-IR spectra of hemicellulose (HC) and carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

2.3.2 抗氧化性

從圖中可以看出，HC和CMHC的羥基清除率都是隨著溶液濃度的增大而增大，但是二者存在一定的差異，在相同質量濃度下，CMHC的抗氧化性要大于HC。

羥基自由基的清除主要有兩種機制:(1)待測樣品通過提供氫(H)離子將羥基自由基還原；(2)待測樣品與能活化H2O2的過渡金屬離子(如Fe2+)螯合，從而抑制羥基自由基的產生。經分析可得，羧甲基化處理半纖維素的羥基自由基清除活性的機制，則可能是由于改性引入的羧甲基基團能與Fe2+離子螯合，抑制H2O2活化，從而抑制Fenton反應中羥基自由基的產生。并提高了其清除羥基自由基(·OH)的能力，即抗氧化性的提高[13-14]。

2.3.3 吸濕、保濕性

圖中可以看出，在0～24 h內，吸濕速率快，在24 h后，吸濕速率趨于緩慢，基本處于飽和狀態。二者趨勢相同，但是在同一時刻，CMHC的吸濕性明顯高于HC。

圖7中，HC和CMHC在絕干環境(干硅膠)中，CMHC的保濕效果略大于HC，二者水分流失都快；在RH=43%的環境中，CMHC的保濕效果明顯優于HC，在前24 h內，水分流失較快，但保濕效果良好，直至72 h后，CMHC的保濕率還能保持在46.3%。

圖5 半纖維素(HC)和羧甲基半纖維素(CMHC)的抗氧化性Fig 5 Oxidation resistance of hemicellulose (HC) and carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

通過上述對HC和CMHC的吸濕、保濕性分析，羧甲基基團的引入有利于提高HC的吸濕、保濕性。CMHC在堿化反應中破壞了半纖維素中木聚糖等大分子鏈上羥基之間形成的氫鍵，使糖鏈末端上的羥基基團的吸收位點增加，且在醚化反應中引入的羧甲基基團能與水形成氫鍵，從而提高半纖維素的吸濕性；同時，分子鏈之間還相互交織成網狀，加之與水的氫鍵結合，起到很強的保濕作用。

2.3.4 抑菌性

由圖8可以看出，在相同質量濃度(20 mg/mL)下，HC和CMHC對枯草芽孢桿菌和沙門氏桿菌的抑菌性有所不同。觀察圖中的抑菌圈，HC對兩種菌均無明顯抑制作用；但CMHC對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為14 mm，對沙門氏桿菌的抑菌圈直徑為15 mm，可見羧甲基改性后提高了半纖維素的抑菌能力。

圖6 半纖維素(HC)和羧甲基半纖維素(CMHC)的吸濕性Fig 6 Hygroscopicity of hemicellulose (HC) and carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

圖7 半纖維素(HC)和羧甲基半纖維素(CMHC)的保濕性Fig 7 Moisturizing properties of hemicellulose (HC) and carboxymethyl hemicellulose (CMHC)

根據抑菌性的原理分析，CMHC的抑菌性可能是由于其能夠吸附在細胞的表面，一方面阻止營養物質向細胞內運輸，另一方面改變了細胞膜的選擇透過性，導致細胞質流失，從而質壁分離，起到殺菌抑菌的效果；或者CMHC溶液通過滲透進入細胞體內，和體內帶有電荷的細胞質產生吸附作用，從而發生絮凝現象，擾亂細胞內正常的生理活動或阻斷細菌體內DNA的轉錄從而抑制細菌的生長和繁殖[15]。

圖8 半纖維素(HC)和羧甲基半纖維素(CMHC)對枯草芽孢桿菌和沙門氏桿菌的抑菌效果Fig 8 Antibacterial effects of hemicellulose (HC) and carboxymethyl hemicellulose (CMHC) on Bacillus subtilis and Salmonella

3 結 論

(1)以桉木APMP廢液為原料進行半纖維素的提取，并對其進行羧甲基化改性，在最佳條件(NaOH/ClCH2COOH=1∶2)時，取代度最高為1.47；并對半纖維素和羧甲基半纖維素進行紅外光譜分析，證明半纖維素被成功羧甲基化。

(2)對半纖維素和羧甲基半纖維素進行生物活性分析，最終得CMHC的抗氧化性、吸濕性、保濕性都明顯高于HC，且改性后的CMHC具有較強的抑菌性，為未來在生物醫藥和化妝品領域的發展提供了堅實的理論基礎。