敲低TM4SF1通過靶向PI3K/AKT通路抑制鼻咽癌細胞轉移

陳 慧,魏 柏(華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院血液科,武漢 430077;華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院腫瘤科;通訊作者,E-mail:doctorwb@hust.edu.cn)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤,2013年中國新診斷NPC的患者人數約為42 100[1]。鼻咽癌是起源于鼻咽部黏膜上皮的鱗狀細胞癌,放療是鼻咽癌的主要治療方法,可大大提高患者5年生存率[2]。但是鼻咽癌具有很高的轉移潛能,常常導致治療失敗,同時也是鼻咽癌死亡的主要原因,更好地了解鼻咽癌的轉移機制對于其治療至關重要。鼻咽癌與環境因素、遺傳因素、EB病毒感染有關,此外,癌基因與抑癌基因的相互作用失衡也是鼻咽癌的主要發生機制之一。四跨膜蛋白家族成員1(transmembrane 4 L6 family member 1,TM4SF1)是一種細胞膜蛋白,也被稱為腫瘤相關抗原L6,是一個22 kD大小的四次跨膜蛋白[3]。TM4SF1已經在多種腫瘤中被發現異常高表達[4-6]。此外,TM4SF1在肺癌、胰腺癌和肝癌也被證明能夠促進腫瘤的轉移能力[6-8],但TM4SF1是否與鼻咽癌轉移相關尚不明確。因此,本研究通過在鼻咽癌細胞系HONE1特異性地敲低TM4SF1,觀察TM4SF1是否能夠影響鼻咽癌的轉移能力,并進一步探討其作用機制,以期為鼻咽癌的臨床治療提供一定幫助。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

HONE1細胞系購自ATCC公司,siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司,TM4SF1、AKT、p-AKT、E-cad、N-cad、Vimentin和MMP2抗體購自美國CST公司,LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司,MK2206購自美國selleck公司,Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養及轉染

在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養HONE1細胞,在轉染前將細胞接種于6孔板中,當細胞融合度達到50%左右時,取4 μl的LipofectamineTM2000與5 μl siRNA溶于200 μl的Opti-MEM中孵育10 min,加入6孔板中,孵育48 h,收集細胞進行后續實驗。siTM4SF1序列為5′-GCGATGCTTTCTTCTGTATTT-3′。

1.3 分組與處理

為了探討TM4SF1敲低對HONE1細胞的影響,將HONE1細胞分為正常對照組和TM4SF1敲低組,按照上述轉染步驟分別轉染siNC和siTM4SF1,然后通過Wstern blot和PCR檢測兩組TM4SF1表達及轉移能力。

為了進一步探討TM4SF1是否通過AKT調控HONE1細胞的轉移,將HONE1細胞分為3組:一組不做處理為正常對照組,一組只加AKT特異性抑制劑MK2206為MK2206組,一組同時加siTM4SF1及MK2206為siTM4SF1+MK2206組。然后通過Transwell實驗檢測HONE1細胞的轉移能力。

1.4 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達

將細胞置于1 ml Trizol試劑中室溫裂解5 min,細胞完全裂解后室溫12 000 r/min離心5 min,棄沉淀,加入200 μl氯仿上下震蕩混勻后室溫放置15 min,4 ℃,12 000 r/min離心15 min。吸取上層水相于新離心管中,加入500 μl異丙醇混勻室溫放置10 min,4 ℃,12 000 r/min離心10 min,棄上清,加入75%乙醇,4 ℃,8 000 r/min離心5 min,置于通風櫥晾干后所得白色沉淀即為RNA。使用DEPC水溶解RNA后用分光光度計檢測其濃度和純度。隨后用1 μg總RNA逆轉錄合成cDNA,按20 μl體系進行qRT-PCR。反應條件為:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s,共48個循環;95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。用GAPDH基因作為內參,每組樣品重復3次。TM4SF1-F:5′-CAGCCCTTGGCTTAGCAGA-3′,TM4SF1-R:5′-CCACAATGCTTGGGTTCA-3′。

1.5 Transwell實驗檢測細胞轉移能力

將Transwell小室放在24孔板中，下層裝有0.6 ml的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，并將4×104個HONE1細胞溶于0.2 ml無血清培養基中，并接種在上室中，37 ℃孵育24 h，將細胞用4%多聚甲醛固定40 min，隨后并用結晶紫染色40 min并拍照。

1.6 劃痕實驗檢測細胞轉移能力

將1 000個細胞接種在6孔板中。當細胞融合達到100%時,用200 μl槍頭劃擦細胞。用PBS洗滌,將細胞在不含胎牛血清的培養基中培養24 h,用顯微鏡拍攝細胞。

1.7 Western blot檢測轉移相關蛋白表達

使用RIPA細胞裂解液將HONE1細胞在冰上裂解30 min。4 ℃、14 000g離心10 min,收集上清液。BCA法測量蛋白質濃度。SDS-PAGE凝膠分離蛋白質提取物,并轉印到PVDF膜上。將膜在含有5%脫脂牛奶中封閉2 h,并分別與TM4SF1(1∶1 000)、E-Cad(1∶1 000)、N-Cad(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、MMP2(1∶1 000)、t-AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)及GAPDH(1∶1 000)等一抗4 ℃孵育過夜，隨后分別與兔二抗及鼠二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h。用ECL顯影液對條帶進行顯影。

1.8 統計學分析

使用SPSS 19.0進行統計分析,數據均采用均數±標準差表示,組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染siTM4SF1對HONE1細胞中TM4SF1蛋白和mRNA表達的影響

與對照組相比,轉染siTM4SF1后,HONE1細胞中TM4SF1在蛋白水平顯著降低(80.31±3.11)%,mRNA水平降低(85.13±3.59)%,并且差異均具有統計學意義(P<0.05,見圖1)。這表明siTM4SF1能夠在HONE1細胞內特異性敲低TM4SF1。

與NC組比較,*P<0.05

2.2 敲低TM4SF1對HONE1細胞轉移能力的影響

Transwell實驗和劃痕實驗結果顯示,與對照組相比,敲低TM4SF1后HONE1細胞的轉移能力分別下降(32.79±5.74)%和(34.01±5.31)%,并且差異均具有統計學意義(P<0.05,見圖2)。以上結果表明敲低TM4SF1能夠抑制HONE1細胞的轉移能力。

與NC組比較,*P<0.05

2.3 敲低TM4SF1對HONE1細胞中轉移相關蛋白的影響

通過Western blot檢測轉移相關蛋白,與對照組相比,siTM4SF1組轉移相關蛋白N-cad、Vimentin、MMP2蛋白水平分別下降(52.53±4.82)%,(38.15±2.23)%,(30.32±4.17)%,E-cad蛋白水平明顯升高(76.24±6.29)%,差異均具有統計學意義(P<0.05,見圖3)。

圖3 敲低TM4SF1對HONE1細胞中轉移相關蛋白的影響Figure 3 The effect of knockdown of TM4SF1 on the metastasis-related proteins

2.4 敲低TM4SF1對PI3K/AKT信號通路的影響

Western blot實驗顯示,與對照組比較,siTM4SF1組的p-AKT蛋白水平明顯下降(73.17±8.24)%,差異具有統計學意義(P<0.05),同時t-AKT蛋白水平沒有統計學差異(P>0.05,見圖4)。

與NC組比較,*P<0.05

2.5 MK2206對HONE1細胞轉移能力的影響

用100 nmol/L的MK2206和siTM4SF1處理HONE1細胞后,Transwell實驗顯示,與對照組比較,MK2206組HONE1細胞的轉移能力明顯下降(64.53±5.38)%,此外siTM4SF1+MK2206組相比MK2206組的轉移能力進一步下降為(36.33±4.89)%,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

3 討論

TM4SF1蛋白主要表達于細胞膜和細胞內囊泡,其基因定位于染色體3q21-3q25[8]。有研究表明,TM4SF1能夠與肌球蛋白10和β-肌動蛋白相互作用,從而調節細胞偽足的形成以介導細胞運動和定向遷移[9]。TM4SF1被證明與胰腺癌中吉西他濱的化療敏感性相關[10],同時,TM4SF1能夠影響膀胱癌和胰腺癌等癌癥的轉移能力[11],這些研究表明,TM4SF1在腫瘤的轉移過程中起著至關重要的作用。

與NC組比較,*P<0.05；與MK2206組比較，#P<0.05

AKT是一種蛋白激酶,在細胞內有著許多AKT的底物,AKT通過調節各種底物的活性能夠影響細胞增殖、轉移、存活和代謝等相關功能[12]。在所有實體腫瘤中幾乎都能觀察到AKT的過度激活[13],同時,在小鼠模型中已經證明AKT的過度激活能夠導致腫瘤的發生[14]。AKT的激活受到基因突變和磷酸化、乙酰化和泛素化等各種翻譯后修飾調節[15]。已經有研究證明,TM4SF1能夠通過AKT通路促進肺癌的肺癌和乳腺癌的轉移能力[16,17]。但是TM4SF1在鼻咽癌轉移中的作用尚未有過報道。

本研究通過Transwell實驗證明,敲低TM4SF1后能夠顯著抑制HONE1的細胞轉移能力,同時,E-cad、N-cad、Vimentin及MMP2等蛋白水平也能被TM4SF1敲低明顯改變。由于E-cad及N-cad蛋白的變化為上皮間質轉化過程的重要指標[18],這意味著TM4SF1可能通過上皮間質轉化途徑影響HONE1細胞的轉移能力。此外,本研究證明TM4SF1的敲低能夠顯著降低AKT磷酸化的水平,由于AKT的磷酸化決定AKT是否能夠被激活,因此TM4SF1的敲低能夠明顯抑制HONE1細胞中AKT的激活,有文獻報道AKT的激活可以促進上皮間質轉化過程從而影響細胞的轉移能力[19]。為進一步證明AKT在本研究的作用,使用AKT特異性抑制劑MK2206處理細胞,結果證明MK2206能夠協同增加TM4SF1對HONE1細胞轉移能力的抑制。

綜上所述,本研究證明敲低TM4SF1能夠通過抑制AKT的激活從而抑制HONE1細胞的轉移能力,這提示TM4SF1可能在鼻咽癌的轉移中起到重要作用,或許可以作為鼻咽癌臨床治療的一個重要靶標。