骨髓間充質干細胞對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的抑制作用及其機制

蔣 勵,許 耀,王世龍,湯超亮,陳文鈞(復旦大學附屬華山醫院骨科,上海 200040)

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是一種以關節軟骨退變和關節腔炎癥為主要病理變化的慢性關節退變疾病,會使患者活動受限,并帶來沉重的經濟負擔[1-3]。目前OA的治療方法主要包括減少負重、服用非甾體抗炎鎮痛藥物等,但減少負重并不適合所有病人,因此尋找一種更為有效的治療方法迫在眉睫[4]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作為組織工程學的研究熱點,為OA的治療提供了新的思路。MSCs具有易獲取、培養簡單、增殖速度快及免疫耐受等特點,因此已逐漸用于多種疾病的治療當中。研究也已經證實MSCs能夠定向分為軟骨細胞,而且對損傷軟骨具有修復作用[5,6],但具體作用機制尚不明確。本研究將以白介素1-β(IL-1β)誘導軟骨細胞模擬體外OA模型,探討MSCs對OA的治療作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡雄性SPF級別的SD大鼠10只,體質量約100 g,購于上海斯萊克實驗動物有限公司,合格證號SCXK(滬2012-0002),大鼠在(25±2)℃環境下于鼠籠中自由活動并飲食。

1.2 主要試劑及儀器

Ⅱ型膠原酶購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購于南京凱基生物技術有限公司；重組人白介素-1β(IL-1β)、兔抗B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關的X蛋白(Bax)、細胞外基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-13、核因子-κB(NF-κB)、p-NF-κB、核因子-κB抑制蛋白(IκBα)、p-IκBα及GAPDH多克隆抗體購于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)購于碧云天生物技術有限公司。Epics-XLⅡ流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產品；MK3酶標儀購自美國thermo公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統購自美國伯樂公司。

1.3 大鼠軟骨細胞的制備

將大鼠脫頸處死，無菌分離大鼠膝關節，剝離軟骨面的結締組織，取透明軟骨，用PBS洗滌，將組織剪為1 mm3的小塊。0.25%胰蛋白酶37 ℃預消化30 min，棄清液，加0.2%Ⅱ型膠原酶37 ℃消化4 h，200目濾網過濾，2 000 r/min離心10 min，收集細胞[7,8]。用含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養基重懸細胞，37 ℃、5% CO2培養8-10 d，當軟骨細胞密度達到80%-90%時，傳代，取第3代軟骨細胞進行試驗。

1.4 大鼠BMSCs的分離、培養、純化及鑒定

將大鼠脫頸處死,用75%酒精消毒,PBS沖洗干凈,取大鼠右側脛骨及股骨,去除骨端,暴露骨髓腔,用DMEM/F12培養基充分沖洗骨髓腔并收集骨髓,1 500 r/min離心10 min,收集細胞并重懸。于含有15%胎牛血清的DMEM/F12培養基中培養,每隔3 d換液,去除未貼壁細胞,在細胞融合程度80%時,以1∶3傳代,第3代細胞用于后續實驗。光鏡觀察細胞生長形態,用流式細胞術檢測BMSCs表面標志物,當細胞表面標志物CD90陽性率高于95%,CD34及CD45陽性率均低于5%時,即獲得純度高、均一性較好的BMSCs,用于后續實驗[9,10]。

1.5 細胞分組

將軟骨細胞分為正常對照組(無任何干預)、IL-1β組(10 ng/ml IL-1β)和BMSCs組(軟骨細胞與BMSCs細胞共培養的同時加10 ng/ml IL-1β)。

1.6 CCK-8法檢測細胞活力

將軟骨細胞接種于96孔板,待細胞貼壁后,按1.5分組處理細胞,培養48 h,加入CCK-8試劑孵育4 h,于酶標儀560 nm處測定細胞吸光值(OD值)。

1.7 RT-PCR法檢測細胞中Aggrecan及ColⅡ mRNA表達

按照Trizol試劑盒說明書提取細胞中總RNA，并測定RNA濃度及純度，當RNA純度(OD260 nm/OD280 nm)為1.8時，用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，基于SYBR Green Ⅰ熒光分析的real time PCR檢測，預變性95 ℃，15 min；變性95 ℃，20 s；退火60 ℃，34 s；40個循環。用2-ΔΔCt法統計Aggrecan及ColⅡ mRNA的表達量，以GAPDH為內參。引物見表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot檢測蛋白表達量

收集細胞并裂解，獲得細胞總蛋白。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取30 ng蛋白樣品，12% SDS-PAGE分離蛋白，轉聚偏二氟乙烯膜40 min。2%的BSA室溫下孵育1 h，加一抗(兔抗Bcl-2、Bax,MMP-1,MMP-13,NF-κB,p-NF-κB,IκBα，p-IκBα及GAPDH多克隆抗體，稀釋度均為1∶1 000)4 ℃過夜孵育，室溫孵育二抗[辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，稀釋度為1∶500]，根據化學發光免疫試劑盒說明書在凝膠成像系統中曝光蛋白條帶，分析條帶灰度值。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞活力的影響

與正常對照組比較,IL-1β組細胞活力降低(P<0.01);與IL-1β組比較,BMSCs組活力提高(P<0.01,見表2)。

2.2 BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞中Aggrecan及ColⅡ mRNA表達量的影響

與正常對照組比較，IL-1β組Aggreca mRNA表達量均顯著降低(P<0.01)；與IL-1β組比較，BMSCs組Aggrecan及ColⅡmRNA表達量均顯著提高(P<0.01，見表2)。

表2 BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞活力及Aggrecan、ColⅡ mRNA表達量的影響Table 2 Effect of BMSCs on the viability and the expression of Aggrecan, ColⅡ mRNA in chondrocytes induced by IL-1β

與正常對照組比較,**P<0.01;與IL-1β組比較,##P<0.01

2.3 BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞中Bcl-2、Bax、MMP-1和MMP-13蛋白表達量的影響

與正常對照組比較,IL-1β組Bcl-2表達量下調(P<0.01),Bax、MMP-1、MMP-13蛋白表達量均顯著上調(P<0.01);與IL-1β組比較,BMSCs組Bcl-2表達量上調(P<0.01),Bax、MMP-1、MMP-13蛋白表達量均顯著下調(P<0.01,見圖1、表3)。

圖1 Western blot檢測BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞中Bcl-2、Bax、MMP-1和MMP-13蛋白表達量的影響Figure 1 Effect of BMSCs on the expression of Bcl-2, Bax, MMP-1 and MMP-13 in chondrocytes induced by IL-1β by Western blot

表3 BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞中Bcl-2、Bax、MMP-1和MMP-13蛋白表達量的影響Table 3 Effect of BMSCs on the expression of Bcl-2, Bax, MMP-1 and MMP-13 in chondrocytes induced by IL-1β

與正常對照組比較,**P<0.01;與IL-1β組比較,##P<0.01

2.4 BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞中p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達量的影響

與正常對照組比較,IL-1β組p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達量均顯著上調(P<0.01);與IL-1β組比較,BMSCs組p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達量均顯著下調(P<0.01,見圖2、表4)。

圖2 Western blot檢測BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞中p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達量的影響Figure 2 Effect of BMSCs on the expression of p-NF-κB and p-IκBα in chondrocytes induced by IL-1β by Western blot

表4 BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞中p-NF-κB、p-IκBα蛋白表達量的影響Table 4 Effect of BMSCs on the expression of p-NF-κB and p-IκBα in chondrocytes induced by IL-1β

與正常對照組比較,**P<0.01;與IL-1β組比較,##P<0.01

3 討論

BMSCs是一種從包括骨髓、脂肪、滑膜、肌肉等組織中分離培養獲得的干細胞,培養方法簡單、易于分離、純化,而且有多種分化潛能,在不同的誘導條件下可定向分化未軟骨細胞、神經細胞、成骨細胞等,為組織的修復和再生提供新的治療方法。目前研究發現,BMSCs與軟骨細胞共培養,能顯著地促進細胞的增殖與分化,但其作用機制尚不明確。

軟骨細胞增殖和細胞外基質的合成是生理條件下關節軟骨的基本特征。蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型膠原蛋白(ColⅡ)是細胞外基質的基本成分，二者的表達水平能很好地體現軟骨細胞外基質的合成情況[11],12]。基質金屬蛋白酶(MMPs)是降解細胞外基質成分的主要水解酶，在骨骼發育、骨重建過程中起重要作用。MMP-1和MMP-13能夠水解軟骨組織中的Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖，能水解Ⅳ、Ⅸ膠原蛋白，因此在OA的發生發展過程中扮演重要角色。

本研究采用IL-1β誘導軟骨細胞模擬體外OA模型，使用BMSCs與軟骨細胞共培養，探討BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響，結果表明BMSCs能顯著地提高軟骨細胞活力，上調aggrecan、ColⅡ mRNA表達，并下調MMP-1、MMP-13表達，提示BMSCs通過促進軟骨細胞外基質合成和抑制細胞外基質降解，緩解IL-1β誘導的軟骨細胞損傷。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞中的與炎癥反應密切相關的核轉錄因子,含p50、p52、p65、RelB及c-Rel等5個亞基,其中p50/60常被稱為NF-κB。NF-κB在靜息狀態下,與上游IκB蛋白形成三聚體,在TNF-α、IL-1β及IL-6等炎癥因子刺激下,IκB蛋白從三聚體解離,使p50及p65暴露,其中p65由細胞漿進入細胞核,與DNA增強子特異性位點結合,進而調控靶基因轉錄,影響細胞的增殖、凋亡和炎癥反應等生物學行為。Bcl-2家族是最常見的細胞凋亡調控家族,其中Bcl-2是研究最為廣泛的抗凋亡蛋白,能夠與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體,阻斷凋亡信號傳遞給Caspase家族,促進細胞存活與生長。Bax能自身形成二聚體,傳遞凋亡信號,誘導細胞凋亡。研究顯示,NF-κB信號通路在OA發生發展過程中被高度激活,且阻斷NF-κB信號通路已成為OA治療的手段之一[13-15]。本研究探討BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞中NF-κB信號通路相關蛋白的表達的影響,結果表明BMSCs能顯著地上調Bcl-2表達,下調p-NF-κB、p-IκBα、Bax表達,從而抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥反應及細胞凋亡。

綜上所述,BMSCs能顯著地提高IL-1β誘導的軟骨細胞活力,促進細胞外基質成分的合成,抑制其降解,與上調aggrecan、ColⅡ mRNA表達,下調MMP-1、MMP-13表達有關。而且BMSCs也能顯著地抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥反應及細胞凋亡,與上調Bcl-2表達和下調p-NF-κB、p-IκBα、Bax表達有關。