高效液相色譜法測定可溶微針貼片中蜂毒肽的含量

董智勇,李瑩瑩,魏 芳,陳遠(yuǎn)政,劉 航,徐雨靚,馬 濤,王清清(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物分析教研室,蚌埠 233000;通訊作者,E-mail:mailto:Qingqingwang@bbmc.edu.cn)

可溶微針(dissolving microneedles,DMNs)是一種新型的透皮藥物遞送系統(tǒng),可刺穿角質(zhì)層以增加藥物滲透,其微米大小可避免疼痛而不會影響血管和感覺神經(jīng)末梢。DMNs由水溶性或可生物降解的聚合物組成,插入皮膚內(nèi)的微針針部釋放封裝的藥物,同時在皮膚中徹底溶解或降解,而不會產(chǎn)生生物危害性廢物[1]。

蜂毒肽(melittin,Mel)是蜂毒的主要成分,也是蜂毒中具藥理作用和生物學(xué)活性的主要組分,其由26個氨基酸殘基構(gòu)成的線性多肽,分子量為2 840 Da,其一級結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基順序為NH2-GLY-ILE-GLY-ALA-VAL-LEU-LYS-VAL-LEU-THR-THR-GLY-LEU-PRO-ALA-LEU-ILE-SER-TRP-ILE-LYS-ARG-LYS-ARG-GLN-GLN-COOH[2]。蜂毒肽屬于生物大分子類藥物,與傳統(tǒng)的小分子相比,這些藥物的特點是分子量高,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,難以通過生物膜。目前,越來越多的研究已通過利用DMNs經(jīng)皮遞送各種生物藥物大分子藥物,包括疫苗(抗原),蛋白質(zhì)(抗體、細(xì)胞因子、激素[3]、肽),多糖[4]和核酸[5]等,研究表明利用DMNs經(jīng)皮遞送生物大分子顯示出令人信服的優(yōu)勢和前景[6,7]。

目前,已有研究表明可以采用高效液相色譜法(HPLC)測定可溶微針貼片中小分子類藥物的含量[8,9]。但是關(guān)于可溶微針貼片中蛋白質(zhì)含量測定的報道卻很少,所以本文選取蜂毒肽為模型藥物,利用高效液相色譜法(HPLC)測定可溶微針貼片中蜂毒肽的含量。通過方法學(xué)驗證,保證其結(jié)果準(zhǔn)確可靠,旨在為測定該種新劑型中大分子藥物的質(zhì)量研究提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(LC-15C,日本島津);雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);超聲波清洗器(KQ5200B,昆山市超聲儀器有限公司);十萬分之一電子分析天平(XP 205型,梅特勒-托利多公司);純水儀(Advantage A10,Milli-Q公司)。

1.2 試藥

可溶微針貼片(本課題組自制);蜂毒肽(melittin)對照品(Mel,上海楚肽生物科技有限公司,批號:P181225-ZL257594);透明質(zhì)酸(HA,華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司,批號:1510081);聚乙烯基吡咯烷酮(PVP K90,德國BASF,批號:L96014768E0);乙腈(上海麥克林生化科技有限公司,色譜純);水為超純水;其余所用試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Unitary C185 μm 100A(4.6 mm×250 mm);流動相:A相為0.1%TFA水溶液,B相為0.1%TFA乙腈溶液。采用梯度洗脫,洗脫程序如下:0-25 min,10%-90%B;25-28 min,90%-10%B;28-30 min,保持10%B,洗脫程序共30 min。流速1.0 ml/min,柱溫30 ℃,檢測波長220 nm,進樣量20 μl。

1.3.2 溶液處理與樣品制備 蜂毒肽對照溶液:精密稱取蜂毒肽對照品粉末25.1 mg,置于100 ml容量瓶中,用新沸冷卻后的超純水(脫氧水)溶解并定容至刻度,配制濃度為251 μg/ml的蜂毒肽儲備液。并用新沸冷卻后的超純水(脫氧水)稀釋成適宜濃度的對照品溶液(Mel-solution)。

制針輔料溶液:分別精密稱取HA,PVP K90各100 mg,置于100 ml容量瓶中,用新沸冷卻后的超純水(脫氧水)配制成1 mg/ml可溶微針制針輔料儲備液,并稀釋成適宜濃度的HA和PVP K90溶液。

供試品溶液:參考文獻[8,9],用刀片將微針針部取下來,溶于1 ml新沸冷卻后的超純水(脫氧水)中,作為供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗

取1.3.2項下制備的4種溶液(蜂毒肽對照品、HA、PVP K90、供試品液),按照1.3.1項色譜條件進樣分析,制針輔料溶液色譜圖在與蜂毒肽對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上無色譜峰出現(xiàn),而可溶微針貼片水溶液與蜂毒肽溶液色譜相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰出現(xiàn)(見圖1)。表明在此色譜條件下,制針輔料對蜂毒肽含量測定無干擾。

2.2 線性試驗

精密吸取1.3.2項下制備的蜂毒肽對照品儲備液0.4,0.8,2.0,3.2,4.0,6.0,8.0,10 ml,分別置于10 ml容量瓶中,用超純水定容,得到濃度為10.04,20.08,50.02,80.32,100.4,150.6,200.8,251.0 μg/ml的一系列蜂毒肽標(biāo)準(zhǔn)工作液。進入高效液相色譜儀分析,以蜂毒肽濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程為:Y=16 564x-41 732,R2=0.999 6。結(jié)果表明,蜂毒肽在10.04-251.0 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(見圖2)。

2.3 精密度試驗

2.3.1 日內(nèi)精密度試驗 取濃度為10.04,50.2,200.8 μg/ml的蜂毒肽標(biāo)準(zhǔn)工作液,按1.3.1項下色譜條件連續(xù)測定3次,每次進樣20 μl。記錄峰面積,3個濃度的日內(nèi)精密度RSD均小于2%,平均RSD值為0.9%(見表1)。表明本實驗建立的方法日內(nèi)精密度較好。

2.3.2 日間精密度試驗 取濃度為10.04,50.2,200.8 μg/ml的蜂毒肽標(biāo)準(zhǔn)工作液,按1.3.1項下色譜條件,于3 d內(nèi)每天的相同時段連續(xù)進樣3次。記錄峰面積,3個濃度的日間精密度RSD均小于2%,平均RSD值為1.6%(見表2)。表明本實驗建立的方法日間精密度較好。

圖1 Water、PVP K90、HA、Mel和Mel-DMNs的專屬性試驗色譜圖Figure 1 Specificity chromatograms of Water, PVP K90,HA,Mel solution,Mel-DMNs

圖2 蜂毒肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 The calibration curve of melittin

2.4 加樣回收率試驗

按1.3.2項下方法配制各種貯備液,取1.3.1項下的蜂毒肽、HA和PVP K90儲備液,參考前期研究[8,9]配制藥物輔料混合液,蜂毒肽與混合輔料濃度比為1∶20,1∶10,1∶5,其中混合輔料濃度保持不變,總濃度為200 μg/ml,各輔料均為100 μg/ml,蜂毒肽濃度分別為21.2,42.4,84.8 μg/ml。藥物輔料混合液注入高效液相色譜儀進樣分析,記錄峰面積,代入回歸方程計算濃度,蜂毒肽的平均加樣回收率在98.9%-106.1%之間,RSD值小于2%(見表3)。

表1 蜂毒肽檢測方法的日內(nèi)精密度Table 1 Intraday precision results of melittin detection method

表2 蜂毒肽檢測方法的日間精密度Table 2 Interday precision results of melittin detection method

表3 蜂毒肽的加樣回收率試驗結(jié)果Table 3 Recovery result of determination of melittin

2.5 重復(fù)性試驗

取6片同一批制備的蜂毒肽可溶微針貼片,按照1.3.2項分別制備成供試品溶液,進樣分析,計算每片微針貼片針部蜂毒肽的載藥量,可溶微針貼片中蜂毒肽的平均載藥量為205.2 μg,RSD為0.8%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性考察

取2.5項下某一供試品溶液,分別于0,1,2,4,8,12,24 h進樣,記錄蜂毒肽峰面積,峰面積RSD為1.48%(n=6),表明蜂毒肽供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

3 討論

3.1 波長的選擇

目前也有關(guān)于紫外可見分光光度法和高效液相色譜法測定蜂毒肽及制劑中蜂毒肽含量的研究[10-12]。前期實驗采用紫外可見分光光度計對蜂毒肽對照品溶液和制備微針?biāo)栎o料溶液進行全光譜掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蜂毒肽在220 nm和280 nm處有最大吸收,但280 nm處測得蜂毒肽的峰面積與220 nm相比較低,前者僅為后者的十分之一,220 nm結(jié)果顯示蜂毒肽專屬性良好,故檢測波長選擇220 nm。

3.2 蜂毒肽溶液的配制及保存條件

參考文獻報道的蜂毒肽的配制方法及保存條件[13],因為脫氧水能夠抑制蜂毒肽的結(jié)構(gòu)變化和氧化反應(yīng),故實驗采用新沸后冷卻的超純水配制蜂毒肽對照品溶液及供試品溶液。本實驗中蜂毒肽的穩(wěn)定性考察是將供試品溶液保存于4 ℃冰箱24 h,不同時間點測定其蜂毒肽的含量,其結(jié)果顯示蜂毒肽溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。故配制完成的溶液均保存于4 ℃冰箱中,測定時取出備用。

3.3 含量測定方法比較

參考文獻中報道的蛋白質(zhì)多肽類藥物的含量測定方法有考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)、酚試劑法(Lowry)、二喹琳甲酸法(BCA)[14]和高效液相色譜法(HPLC)[15]。其中前三種方法是利用蛋白質(zhì)與特定物質(zhì)顯色的特性測定蛋白質(zhì)和多肽類藥物的含量,但由于實驗過程中蛋白質(zhì)多肽類藥物的溶劑或添加劑、劑型中的輔料影響可能會對顯色結(jié)果的正確性造成影響[14]。而高效液相色譜法(HPLC)由于其專屬性好、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點常被用來測定測定蛋白質(zhì)多肽類藥物的含量,在測定其含量時可以通過調(diào)節(jié)流速、流動相的酸度、有機相的種類等方法達(dá)到分離藥物與雜質(zhì)或者輔料的目的[16],實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)論

本文建立了HPLC法測定可溶微針貼片中蜂毒肽的含量,此方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、精密度高、選用的制針材料對測定蜂毒肽的含量無干擾,可作為可溶微針貼片中蜂毒肽含量測定的質(zhì)量控制方法,并為微針中蛋白質(zhì)類等生物大分子藥物的含量測定提供理論基礎(chǔ)。