鈣轉運蛋白Gdt1過表達對釀酒酵母蛋白酶A胞外分泌的影響

宋露露，劉小航，郭學武，陳葉福*，肖冬光*

1(工業發酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學)，天津，300457)2(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

釀酒酵母蛋白酶A(saccharopepsin; EC 3.4.23.25)是一種定位于液泡的水解酶，在胞內蛋白的成熟、激活以及多倍體酵母生孢等生理生化過程中起著重要作用[1-3]。然而，在脅迫條件下，酵母細胞會分泌蛋白酶A到細胞外[4-6]。對于啤酒而言，釀酒酵母分泌到發酵液中的蛋白酶A會降解泡沫陽性蛋白-脂質轉移蛋白LTP1，從而降低啤酒的泡沫穩定性，影響啤酒的感官質量[7-9]。因此，降低釀酒酵母細胞中蛋白酶A的外泌，可以有效地提高啤酒泡沫穩定性。

蛋白酶A由PEP4基因編碼，PEP4基因經過轉錄和翻譯后，在核糖體上合成前蛋白酶A原[2]。前蛋白酶A原經過內質網和高爾基體修飾后，形成了蛋白酶A原。蛋白酶A原在反面高爾基體網絡結構(trans-Golgi network，TGN)中被液泡分選受體識別并結合，引導其轉運到液泡內，最終蛋白酶A原在液泡中通過自我激活或者是蛋白酶B的作用下形成成熟的蛋白酶A[1,10]。酵母細胞中的液泡分選受體有多種，其中最典型的是液泡分選受體Vps10(I型跨膜受體蛋白)[11-13]。最初發現Vps10定位于晚期高爾基體腔室(the late Golgi compartment)，能正確分選羧肽酶Y定位于液泡[13]。研究表明，通過提高Vps10的表達水平可以促進更多的蛋白酶A被分選到液泡中，從而降低了蛋白酶A的胞外分泌水平[14]。由此可知，加強蛋白酶A的液泡分選是減少蛋白酶A胞外分泌的一種有效方法。

KIENZLE和VON BLUME等[15]提出一條不同于受體介導的分選途徑的新的分選途徑，這條分選途徑分選蛋白依靠的是TGN腔內Ca2+瞬時增加；哺乳動物細胞中TGN上的SPCA1(secretory pathway calcium ATPase 1)可以誘導更多的Ca2+流入TGN腔內，導致TGN腔內Ca2+瞬時增加，間接促進蛋白的分選。Pmr1是高爾基體膜上的鈣轉運蛋白，它是SPCA1的酵母同源物，也影響液泡蛋白的分選[16]。酵母細胞中缺失Pmr1后，原本定位于液泡的羧肽酶Y被分選到液泡的時間被延長，最終導致羧肽酶Y異常分泌到細胞外[16]。實驗室前期已經研究表明，Pmr1缺失阻礙部分蛋白酶A被運輸到液泡中，加強了蛋白酶A的胞外分泌；Pmr1過表達促進了蛋白酶A的液泡分選，降低蛋白酶A的胞外分泌水平[17]。除了Pmr1，還有另一個定位于高爾基體的Ca2+轉運蛋白Gdt1(由GDT1基因編碼)，與Pmr1功能相同，參與調控高爾基體和細胞質中的鈣離子水平[18-19]。推測，Gdt1可能也影響蛋白酶A的液泡分選，間接影響蛋白酶A的胞外分泌。基于以上結果，本研究以W303-1A為親本菌株，將親本菌株中的Gdt1進行過表達，以此來調控蛋白酶A的液泡分選，探究鈣轉運蛋白Gdt1對蛋白酶A胞外分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

本研究所用的菌株和質粒歸納于表1。

表1 本研究所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in the this study

1.1.2 主要培養基

LB(Luria-Bertani)培養基(g/L)：酵母浸粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10，使用時添加氨芐青霉素使其最終質量濃度為0.1 g/L。

YEPD(yeast extract peptone dextrose)培養基(g/L)：酵母浸粉 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20。向其中添加G418使其最終質量濃度為0.8 g/L，用來篩選GDT1過表達菌株轉化子。

配制以上LB和YEPD固體培養基時，添加20 g/L瓊脂粉即可。

低氮麥芽汁培養基：粉碎的麥芽和水的混合物(料水比為1∶4)于65 ℃糖化至碘檢完畢，時間大約為1 h左右；過濾后煮沸1 h：再次過濾后用糖度計調節表觀糖度為5 °Brix，然后向其中添加葡萄糖調節其表觀糖度為10 °Brix。

以上所有培養基的滅菌條件均為：115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑和酶

合成多肽(MOAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu(Dnp)-NH2)，委托南京萊昂生物科技有限公司合成；氨芐青霉素和遺傳霉素(G418)，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；PCR純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒，購自美國Omega公司。

限制性內切酶BglII、LATaq和PrimerSTAR DNA聚合酶，購自大連TaKaRa公司；閃電克隆試劑盒，購自北京博奧龍免疫技術有限公司。

1.1.4 主要儀器和設備

垂直流超凈工作臺(ZHJH-C1115B)和搖床(ZWY-2102C)，上海智城分析儀器制造有限公司；生化培養箱(LRH-250A)，上海滬粵明科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計(UV-1200)，上海美譜達儀器有限公司；熒光分光光度計(RF-5301)，日本島津公司；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計

根據NCBI數據庫(http: // www. ncbi. nlm. nih. gov/)中S.cerevisiaeS288c菌株的基因組序列、質粒pUG6中的KanMX基因序列和質粒YEp-P的DNA序列，設計用于過表達GDT1基因的引物，見表2。

表2 用于過表達GDT1基因的引物aTable 2 Primers used for GDT1 overexpression

注：a下劃線表示相鄰兩片段之間～50 bp的重疊序列，加粗堿基表示限制性酶切位點BglII

1.2.2 大腸桿菌(E.coli.DH5α)的轉化

將經酶切線性化的質粒和PCR擴增獲得的片段通過閃電克隆試劑盒進行連接。將連接產物轉入到E.coli.DH5α感受態細胞中。通過質粒小提試劑盒提取質粒并且進行酶切驗證。

1.2.3 釀酒酵母(W303-1A)的轉化

通過醋酸鋰(LiAc)轉化法[20]將構建GDT1基因過表達菌株所需的片段轉化入W303-1A中，通過含有G418抗性的YEPD平板篩選轉化子，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取轉化子的基因組進行PCR驗證。

1.2.4 啤酒發酵工藝

從斜面上挑取1環釀酒酵母菌株接入到裝有5 mL 10 °P麥汁的玻璃試管中，30 ℃、180 r/min培養12 h；將試管中培養好的菌液倒入裝有50 mL 10 °P麥汁的三角瓶中，16 ℃靜置培養36～72 h至菌株達到對數期后期；以10%接種量接入到裝有135 mL 10 °P麥汁發酵培養基的三角瓶中，16 ℃靜置發酵，每隔24 h稱重，當2 d之間的質量相差小于0.1 g，發酵結束。發酵期間取樣，取樣時間為0、1、3、5、7 d，測定生物量、碳源消耗、氮源消耗；當發酵結束后測定乙醇體積分數、剩余還原糖含量以及蛋白酶A的胞內外活力。

1.3 分析方法

1.3.1GDT1基因的mRNA水平測定

采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法[4]檢測基因GDT1的相對表達量。

1.3.2 生物量的測定

采用比濁法測定生物量。發酵過程中取樣，每次取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min，去上清液后用蒸餾水水洗2次，稀釋菌液到合適的濃度。以蒸餾水為空白對照，600 nm下測定菌液的吸光值。以發酵時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.3 表觀糖度的測定

采用手持糖度折光儀測定發酵過程中表觀糖度的變化。

1.3.4 α-氨基氮含量的測定

采用茚三酮比色法測定發酵過程中α-氨基氮的含量變化[21]。

1.3.5 乙醇體積分數的測定

采用GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中的密度瓶法(標溫20 ℃)測定。

1.3.6 還原糖的測定

采用斐林試劑法測定發酵結束時發酵液中還原糖的含量。

1.3.7 蛋白酶A活力的測定

采用KONDO等報道的熒光底物法[22]測定蛋白酶A活力。

在每支測樣玻璃試管中分別加入1 370 μL蒸餾水、1 500 μL Na2HPO4-C6H8O7緩沖液和100 μL待測樣品；在避光的條件下，向上述混合液中加入12 μL熒光底物，混勻后將試管放入37 ℃水浴鍋中反應30 min；30 min后，取出測樣玻璃試管并加入18 μL NaOH (0.5 mol/L)終止反應；用熒光分光光度計測定蛋白酶A的活力(測量時，設定分光光度計的參數為Ex=328 nm，Em=393 nm，狹縫寬度為1.5 nm)。

2 結果與討論

2.1 鈣轉運蛋白Gdt1過表達菌株的構建

2.1.1 重組質粒YEp-P-GDT1的構建

以親本菌株的基因組為模板，用表2中的引物GDT1-F/GDT1-R擴增獲得GDT1基因片段。限制性內切酶BglⅡ單酶切質粒YEp-P，使之線性化。用閃電克隆試劑盒將經BglⅡ酶切線性化的載體YEp-P與GDT1基因片段進行連接。然后將連接產物轉入到E.coliDH5α感受態中進行擴增，構建質粒YEp-P-GDT1，構建過程如圖1所示。

圖1 質粒YEp-P-GDT1的構建流程Fig.1 The flow chart of the plasmid YEp-P-GDT1construction

用限制性內切酶BglⅡ單酶切質粒YEp-P-GDT1，然后對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示。YEp-P-GDT1質粒經BglⅡ酶切后出現2條條帶，大小分別與BglⅡ酶切線性化的質粒YEp-P大小(6 950 bp)以及與BglⅡ酶切的GDT1基因片段大小(853 bp)相同，表明質粒YEp-P-GDT1構建成功。

M-DL15 000 DNA marker；1-YEp-P質粒的BglⅡ酶切結果；2-YEp-P-GDT1質粒的BglⅡ酶切結果圖2 質粒YEp-P-GDT1的驗證Fig.2 The verification of the plasmid YEp-P-GDT1

2.1.2 Gdt1過表達菌株轉化子的獲得及驗證

過表達親本菌株W303-1A中的GDT1基因用的是同源重組依賴型DNA組裝法。

PCR擴增獲得構建GDT1基因過表達菌株所需片段：GDT1+A(GDT1基因的上同源臂，以親本菌株基因組為模板，用引物GDT1+A-F/GDT1+A-R擴增)，Kan+GDT1(loxP-KanMX-loxP，以pUG6質粒為模板，用引物Kan+GDT1-F/Kan+GDT1-R擴增)，P+GDT1(PGK1p-GDT1-PGK1t，以YEp-P-GDT1質粒為模板，用引物P+GDT1-F/P+GDT1-R擴增)和GDT1+B(GDT1基因的下同源臂，以親本菌株基因組模板，用引物GDT1+B-F/GDT1+B-R擴增)。所得片段與預期大小一致(如圖3)，表明過表達GDT1基因所需片段正確。

M-DL5000 DNA marker；1-GDT1+A(1 025 bp)；2-Kan+GDT1(1 661 bp)；3-P+GDT1(2 670 bp)；4-GDT1+B(1 026 bp) 圖3 過表達GDT1基因所需DNA片段準備Fig.3 Preparing of the DNA fragments used for GDT1overexpression

將以上片段通過LiAc轉化法轉入到親本菌株感受態中，經過G418抗性YPD平板篩選獲得轉化子，對轉化子進行PCR驗證，結果如圖4所示。以過表達GDT1基因轉化子的基因組為模板，(A+K)+GDT1-F/(A+K)+GDT1-R、Kan+P-F/Kan+P-R和(P+B)+GDT1-F/(P+B)+GDT1-R為引物分別擴增出1 642、1 493和1 201 bp大小的條帶，與驗證引物預期擴增的片段大小一致；將上述PCR擴增體系中的轉化子基因組替換為親本菌株基因組，擴增不到產物，說明GDT1基因過表達菌株構建成功，將其命名為W+GDT1。

M-DL5000 DNA marker；1-以(A+K)+GDT1-F/(A+K)+GDT1-R為引物，從W+GDT1的基因組上擴增得到的產物(1 642 bp)；2-以(A+K)+GDT1-F/(A+K)+GDT1-R為引物，從親本株基因組上擴增得到的結果；3-以Kan+P-F/Kan+P-R為引物，從W+GDT1的基因組上擴增得到的產物(1 493 bp)；4-以Kan+P-F/Kan+P-R為引物，從親本株基因組上擴增得到的結果；5-以(P+B)+GDT1-F/(P+B)+GDT1-R為引物，從W+GDT1的基因組上擴增得到的產物(1 201 bp)；6，以(P+B)+GDT1-F/(P+B)+GDT1-R為引物，從親本株基因組上擴增得到的結果圖4 過表達GDT1轉化子的PCR驗證Fig.4 The PCR verification of the transformants harboringGDT1 overexpression

2.1.3 Gdt1過表達菌株中GDT1基因轉錄水平的測定

測定菌株W+GDT1中Gdt1的相對表達水平來考察過表達GDT1基因對Gdt1蛋白表達量的影響(結果見圖5)。過表達GDT1后，與親本菌株相比，菌株W+GDT1中GDT1的相對表達水平提高了23.41倍。說明過表達GDT1基因的確提高了菌株中GDT1基因的轉錄水平。

圖5 GDT1基因的相對表達水平Fig.5 The relative expression level of GDT1

2.2 鈣轉運蛋白Gdt1過表達對蛋白酶A胞外分泌的影響

為了考察Gdt1是否也同Pmr1一樣，在蛋白酶A的液泡分選過程中起相同的作用，將Gdt1過表達菌株W+GDT1、Pmr1過表達菌株W+PMR1以及親本菌株W303-1A同時在低氮脅迫條件下進行發酵，然后測定了其胞內外蛋白酶A活力(結果見圖6)。

圖6 發酵結束時菌株W+GDT1、W+PMR1和W303-1A的蛋白酶A活力Fig.6 PrA activity of the strains W+GDT1, W+PMR1 and W303-1A at the end of fermentation

圖6顯示，發酵結束時，菌株W+GDT1的胞內蛋白酶A的活力較親本菌株提高了12.59%，胞外蛋白酶A活力較親本菌株降低了18.81%；菌株W+PMR1的胞內蛋白酶A活力較親本菌株提高了11.06%，胞外蛋白酶A活力較親本菌株降低了12.42%。過表達Gdt1或者過表達Pmr1都提高了胞內蛋白酶A的酶活力，降低了胞外蛋白酶A的酶活力，說明過表達Gdt1可能如過表達Pmr1一樣，促進蛋白酶A的液泡分選，致使更多的蛋白酶A被運輸到液泡中，進而相應的外泌到細胞外的蛋白酶A量減少。與親本菌株相比，過表達Gdt1后，可能單位時間內運輸較多的Ca2+進入TGN腔內，縮短了TGN腔內Ca2+水平瞬時增加的時間，這可能是過表達Gdt1促進蛋白酶A的液泡分選，降低蛋白酶A的胞外分泌的原因之一。研究表明，Gdt1在液泡蛋白羧肽酶Y糖基化過程中有重要的作用，羧肽酶Y的異常糖基化可能降低其被分選到液泡的效率[23-24]。過表達GDT1基因后，細胞內Gdt1蛋白表達量提高，可能促進了蛋白酶A前體物質的糖基化過程的快速完成，進而提高分選其到液泡的效率，從而更多的蛋白酶A被分選到液泡中，這可能是過表達Gdt1促進蛋白酶A的液泡分選，降低蛋白酶A的胞外分泌的另一個原因。

Pmr1在液泡蛋白酶(蛋白酶A和羧肽酶Y)的液泡分選過程中起作用[16-17]。如Pmr1一樣，Gdt1也可能間接調控其他液泡蛋白酶(除蛋白酶A之外)的液泡分選，另2個典型的液泡蛋白酶是羧肽酶Y和蛋白酶B。羧肽酶Y編碼基因和蛋白酶B編碼基因經過轉錄和翻譯后，形成各自的前體物質，前體物質經過內質網和高爾基體的修飾后，最終被分選到液泡中激活成為有活性的羧肽酶Y和蛋白酶B[25]。由此可知，在液泡中才存在有活性的羧肽酶Y和蛋白酶B，2種蛋白酶在液泡中才發揮其作用，在分選蛋白酶A原到液泡的過程中不會起作用。蛋白酶A原在液泡中經過蛋白酶B的特異蛋白水解作用或者自我激活作用，才形成具有活性的蛋白酶A[1,10]。若過表達Gdt1影響了蛋白酶B的液泡分選，引起液泡中有活性的蛋白酶B的含量發生變化，是否也會間接影響蛋白酶A的胞內外酶活力？過表達Gdt1可能會促進蛋白酶B的液泡分選，使更多的蛋白酶B被分選到液泡中，液泡中較多的蛋白酶B會加快液泡中的蛋白酶A原轉變為具有活性的蛋白酶A；蛋白酶B在蛋白酶A的液泡分選過程中不起作用，分選到液泡中的蛋白酶A原的量不會因液泡中蛋白酶B量的增加而發生改變，因此液泡中蛋白酶B量的增加只是縮短了液泡中蛋白酶A原轉變為有活性的蛋白酶A的時間，并不會影響液泡中最終的蛋白酶A的酶活力；分選到液泡中的蛋白酶A原的量沒有改變，相對應的外泌到細胞外的蛋白酶A原的量也不會改變，細胞外的蛋白酶A原在自我激活的作用下轉變為有活性的蛋白酶A[26]，從而胞外蛋白酶A的酶活力也不會因液泡中蛋白酶B量的增加發生改變。顯然，在過表達Gdt1影響蛋白酶B的液泡分選的情況下，液泡中蛋白酶A酶活力是由分選到液泡中的蛋白酶A原的量決定的，并不會受蛋白酶B的影響。

2.3 鈣轉運蛋白Gdt1過表達對菌株基本發酵性能的影響

2.3.1 對發酵過程中菌株的生長繁殖、碳源和氮源吸收能力的影響

發酵期間各菌株的生物量、各菌株發酵液中的表觀糖度以及α-氨基氮含量測定結果見圖7。

由圖7-a可知，菌株W+GDT1在發酵期間的生物量變化趨勢和親本菌株W303-1A相同：在第1天，菌體大量的繁殖，繁殖速度最快；從第2天到第5天菌體的繁殖速度逐漸緩慢，第6天到第7天，發酵液中菌體的濃度不變，即從第5天開始進入穩定期；菌株W+GDT1發酵期間相同的時間內產生的菌體量與親本菌株基本相同。在酵母細胞中，過表達GDT1不會影響酵母細胞的生長繁殖。

由圖7-b可知，菌株W+GDT1與親本菌株W303-1A的耗糖曲線趨勢基本上一致。結合各菌株發酵期間生物量的變化趨勢圖(圖7-a)分析：前5 d，菌體大量生長繁殖，消耗大量的糖類合成菌體細胞成分和代謝產物的碳架；5 d之后，菌體生長繁殖速度逐漸變慢，最終生物量趨于恒定不變，耗糖的速度也逐漸變慢最后趨于平穩。由此可知，過表達Gdt1不會影響酵母細胞對碳源的吸收能力。

由圖7-c可知，菌株W+GDT1和親本菌株W303-1A對發酵液中α-氨基氮的利用情況曲線趨勢大致相同。結合各菌株發酵期間生物量的變化趨勢圖(圖7-a)分析：前5 d，由于菌體大量迅速的繁殖，菌體迅速吸收大量的氮源用于菌體自身生長所需，此時發酵液中α-氨基酸的含量下降的較快；5 d之后，菌體的繁殖速度逐漸變慢，最終在5 d之后發酵液中的菌濃趨于穩定不變，相應的菌體對發酵液中的α-氨基氮的利用速度逐漸緩慢，最后也趨于平穩。菌株W+GDT1在發酵的各個時期消耗的α-氨基氮的含量和親本菌株W303-1A基本一致。過表達Gdt1的表達量不會影響酵母細胞對氮源的吸收能力。

a-生物量；b-碳源消耗；c-氮源消耗圖7 發酵期間菌株W+GDT1和W303-1A的生物量、耗糖和耗氮的比較Fig.7 Comparing of biomass, sugar consumption, nitrogen consumption of the strains (W+GDT1 and W303-1A) during fermentation

2.3.2 對發酵結束時菌株發酵液中的乙醇體積分數和殘糖含量的影響

發酵結束時，對菌種發酵液中的乙醇體積分數和殘糖的含量進行了測定，測定結果見表3。發酵結束時菌株W+GDT1和親本菌株發酵液中乙醇體積分數和殘糖含量與親本菌株W303-1A相比較沒有顯著性差異。過表達Gdt1不會影響釀酒酵母菌株的產乙醇能力。發酵結束時，各菌株發酵液中剩余的還原糖含量基本相同，這與圖7-b顯示的各菌株對碳源的吸收能力基本一致的結論相對應，即過表達Gdt1不會影響菌株的碳源吸收能力，因而發酵液中剩余還原糖的量也基本相同。

表3 菌株W+GDT1和W303-1A發酵液中乙醇體積分數和殘糖含量的比較Table 3 Comparing of ethanol production and residualreducing sugar content in the broth fermented with thestrains (W+GDT1 and W303-1A)

3 結論

蛋白酶A是釀酒酵母的一種液泡水解酶，在釀酒酵母細胞中起著不可替代的生理生化作用。在脅迫條件下，可以從釀酒酵母細胞中釋放到發酵培養基中，影響啤酒的泡沫穩定性。本研究將鈣轉運蛋白Gdt1編碼基因GDT1在組成型強啟動子PGK1的調控下過量表達，探究了Gdt1過表達對蛋白酶A的胞外分泌的影響。與親本菌株相比，Gdt1過表達菌株的胞內蛋白酶A活力提高了12.59%，胞外蛋白酶A活力降低了18.81%。確定了過表達Gdt1能提高蛋白酶A的液泡分選，并顯著地降低了蛋白酶A的胞外分泌，為選育低蛋白酶A外泌的優良工業釀酒酵母以及改善啤酒泡沫穩定性提供了思路和參考。