L-巖藻糖激酶/GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶的克隆表達及酶學性質研究

魏萬濤，李夢麗，江波，張濤

(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

核苷酸糖鳥嘌呤5′-二磷酸-β-L-巖藻糖(5′-diphospho-β-L-fucose, GDP-L-巖藻糖)是廣泛存在于生物中的糖基供體和代謝中間體[1]。在真核生物中，它主要用作重要的糖基化供體和其他糖基化核苷酸的前體[2]，參與血型的ABH抗原決定簇并介導細胞粘附和識別[3],是調節生命代謝不可或缺的物質。此外，GDP-L-巖藻糖是合成人乳寡糖的重要中間產物，為巖藻糖基化反應提供了巖藻糖基供體，并將活化的L-巖藻糖與內質網(endoplasmic reticulum, ER)和高爾基糖基化連接[4]，也在人乳寡糖的合成中起重要作用。由于GDP-L-巖藻糖化學合成的復雜性和高昂的成本，通過基因工程構建代謝工程細菌生產GDP-L-巖藻糖是一種有效的方法。目前，GDP-L-巖藻糖的生物合成包括細菌、哺乳動物和植物中的從頭途徑和補救途徑。

L-巖藻糖激酶/GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶(fucose pyrophosphorylase, FKP)是GDP-L-巖藻糖補救途徑中的一種雙功能酶，最初僅在哺乳動物細胞中發現[5]。隨后，在水稻和擬南芥中也鑒定了FKP的存在[6-7]。COMSTOCK等[8]從脆弱擬桿菌中鑒定出第一個雙功能酶FKP，該酶模擬哺乳動物的補救途徑，利用外源底物L-巖藻糖、ATP和GTP酶法合成GDP-L-巖藻糖。使用FKP合成GDP-L-巖藻糖涉及2個獨立的催化過程。首先，L-巖藻糖激酶催化L-巖藻糖生成巖藻糖-1-磷酸，并消耗ATP提供能量，然后在巖藻糖-1-P-鳥嘌呤轉移酶和GTP的作用下，巖藻糖-1-磷酸合成GDP-L-巖藻糖[9-10]。簡而言之，FKP可以通過1-磷酸巖藻糖中間體將巖藻糖轉化為GDP-L-巖藻糖。這種轉化在所有的擬桿菌中都是保守的，并且雙功能酶FKP已被有效地用于體外合成和修飾糖底物和衍生物[11-12]。目前，FKP已成功引入大腸桿菌和釀酒酵母，并已證明FKP依賴的巖藻糖類似物可以有效地摻入細菌和真菌的多糖中[13-14]。這種雙功能酶具有廣泛的底物特異性，包括L-巖藻糖、D-阿拉伯糖、L-半乳糖和L-巖藻糖的化學修飾衍生物[11]。

鑒于FKP在巖藻糖基化多糖的生物合成中的重要性，本研究從脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)的基因組DNA中克隆得到FKP的基因，在大腸桿菌中過表達，并對其酶學性質進行表征，為FKP的研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

基因來源菌株脆弱擬桿菌(24309),中國工業微生物菌種保藏中心；E.coliDH5α 和E.coliBL21(DE3)分別用于質粒的克隆擴增和重組酶的過量表達，生工生物工程(上海)有限公司；實驗中使用的質粒載體pET-22b(+),Novagen公司。

1.1.2 培養基

基因工程菌E.coli的培養基使用LB培養基(g/L)：酵母提取物5、胰蛋白胨10和NaCl 10。滅菌條件：121 ℃，20 min。

1.1.3 主要試劑

高保真DNA聚合酶、限制性內切酶、Solution I連接酶、DNA Marker,寶生物工程(大連)有限公司；L-巖藻糖和ATP,上海麥克林生化科技有限公司；巖藻糖-1-P和GDP-L-巖藻糖標準品,Sigma-Aldrich公司；瓊脂糖、50×TAE緩沖液、核酸染料、GTP、感受態細胞制備試劑盒、細菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒等,生工生物工程(上海)有限公司；質粒抽提試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司；引物合成和測序由天霖生物科技無錫有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 FKP基因的克隆及重組質粒的構建

將基因來源菌株脆弱的擬桿菌(Bacteroidesfragilis)在含有無纖溶酶原的綿羊血液的胰蛋白和大豆瓊脂培養基中厭氧培養，挑取單菌落接種于種子培養液中，參照Ezup柱式基因抽提手冊對基因組DNA進行提取。以B.fragilis基因組為模板，引物序列為F(5′-CGCCATATGCAAAAACTATCTTTACCGC-3′)和R(5′-CCCTCGAGTGATCGTGATAC TTGGAATC-3′)，PCR擴增程序為：98 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，72 ℃延伸5 min。將PCR合成的靶基因片段連接至C末端具有6-his標簽的載體pET-22b(+)，然后轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞。通過篩選和測序轉化體獲得了攜帶FKP基因的重組表達載體。重組質粒命名為pET-22b(+)-FKP。

1.2.2 重組酶的誘導表達和純化

將構建的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。將重組菌株接種到4 mL LB培養基中，然后將種子溶液轉移至含有氨芐青霉素(100 μg/mL)和IPTG(0.1 mmol/L)的LB液體培養基中，并在16 ℃下培養24 h。按照WANG等[15]所述的AsfTase方法，收集、破壞和純化帶有pET-22b(+)-FKP變異體的大腸桿菌BL21(DE3)細胞。用SDS測定重組FKP的分子質量和純度。在SDS-PAGE實驗中，凝膠組分為120 g/L分離凝膠和40 g/L濃縮凝膠。電泳后，將凝膠用考馬斯亮藍R-250染色，然后用5%(體積分數)乙醇和10%(體積分數)乙酸溶液脫色。

1.2.3 重組FKP酶活測定

通過檢測L-巖藻糖轉化為GDP-L-巖藻糖的含量來確定FKP的酶活性。在400 μL反應系統中，添加Mg2+(5 mmol/L)，ATP(2.5 mmol/L)，GTP(2.5 mmol/L)并溶解在含有底物L-巖藻糖(10 mmol/L)的緩沖液Tris-HCl(50 mmol/L，pH 7.5)中。將適當稀釋的FKP純酶溶液加入到反應體系中，并使反應溶液在45℃下反應10 min，最后煮沸10 min以終止酶反應。將反應液離心(10 000 r/min，2 min)后，提取上清液并通過0.22 μm微孔膜過濾，并使用HPLC測量GDP-L-巖藻糖，以計算FKP的酶活性。酶活性定義：在1 min內產生1 mol/L GDP-L-巖藻糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 重組FKP酶學性質

金屬離子對FKP的影響：由于在蛋白質純化過程中已通過EDTA去除了酶溶液中的金屬離子，因此純化的酶溶液不含金屬離子。在存在Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+和Fe2+的情況下，研究了不同濃度的金屬離子對FKP酶活性的影響。金屬離子的濃度為0.02、0.5、2、5、8、12、15、18 mmol/L。以沒有金屬離子的酶溶液用作對照，其相對酶活性定義為100%。其他條件與上述相同。

最適pH：在pH 4.0～11.0下測量pH對FKP酶活性的影響。所有緩沖液濃度均為50 mmol/L，包括HAc-NaAc緩沖液(pH 4.0～6.0)、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH 6.0～7.5)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～9.0)和甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 9.0～11.0)。除pH緩沖液外，反應系統的其他條件和檢測方法與酶活性的測定一致。同時，最高酶活性對應的pH是FKP的最佳pH，并且將最佳pH下的相對酶活性定義為100%。

最適溫度和溫度穩定性：通過在25～70 ℃的溫度范圍內進行酶反應并測量產物生成量來確定FKP的最適溫度。在最適pH條件下測定FKP在各種溫度下的熱穩定性。FKP分別在4、12、20、28、37、45 ℃孵育，每隔一段時間采樣一次測定殘留酶活性，初始酶活性為100%。

為了確定動力學參數，反應系統由稀釋的FKP酶溶液，Mn2+(2 mmol/L)，L-巖藻糖(0.25～12 mmol/L)和Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.5)。在45 ℃下反應10 min后，通過沸水浴終止酶促反應，并測量合成的GDP-L-巖藻糖的量。用Lineweaver-Burk雙重倒數法確定了FKP的米氏常數Km和最大反應速率Vmax，并計算出催化速度常數Kcat和催化效率Kcat/Km。沒有酶溶液的體系用作空白對照。

1.2.5 GDP-L-巖藻糖的生物合成

在最佳條件下測定了GDP-L-巖藻糖的生物轉化。轉化溶液(30 mL)包含Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.5)、10 mmol/LL-巖藻糖、10 mmol/L ATP、10 mmol/L GTP、300 mU/mL FKP和最終濃度為2 mmol/L的Mn2+。在pH 7.5和45 ℃的條件下，反應在酶反應器中進行12 h。通過HPLC分析產物和底物。

1.2.6 數據統計分析

實驗數據結果采用Excel進行統計和分析。酶學性質、生物合成曲線用OringinPro 8進行繪制和分析。

2 結果與分析

2.1 基因克隆表達與序列分析

通過PCR克隆成功地從脆弱擬桿菌(CICC 24309)分離了編碼L-巖藻糖激酶/GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶基因的基因。該基因片段的總長度為2 850 bp，編碼949個氨基酸殘基。從GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)下載了來自不同微生物的FKP序列，并與DNAMAN進行比對以鑒定保守的基因序列，結果見圖1。

圖1 不同來源雙功能酶序列對比Fig.1 Sequence comparison of bifunctional enzymes from different sources

來自不同來源的FKP的同源性在50%～80%之間。來源于Bacteroidesfragilis的FKP氨基酸序列(蛋白ID RDT75264.1)與B.caccae(蛋白ID wp_122365145.1)同源性最高，為75.24%。與Alloprevotellasp. (蛋白 ID RKV80205.1)、Mangrovibacteriumdiazotrophicum(蛋白 ID WP_120275767.1)、Parabacteroidesgoldsteinii(蛋白 ID RLT85747.1)、Prevotellasp. (蛋白 ID WP_122374089.1) 和Parabacteroidesmerdae(protein ID WP_122131458.1)的同源性分別為57.84%、58.86%、70.13%、62.42%和70.69%。FKP的理論等電點(pI)和分子質量(Mw)通過ExPASy(www.expasy.org)計算得出，分別為5.74/105 666.93 Da。

2.2 重組酶分離純化

為了鑒定FKP的性質，通過PCR擴增該酶(圖2)，并將其克隆到含有NdeI和XhoI限制性酶切位點的表達載體pET-22b(+)中。將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。由于在質粒構建過程中添加了6個組氨酸標簽，因此使用Ni2+螯合瓊脂糖快速流動色譜柱純化目標蛋白，純化后酶的比酶活為(5.59±0.32) U/mg。通過SDS-PAGE分析IPTG誘導的大腸桿菌BL21(DE3)重組酶，并在106 kDa處顯示出明顯的蛋白帶(圖3)，說明重組FKP被成功誘導表達。

M-DNA Marker;1-雙酶切;2-FKP基因全長2 850 bp圖2 核酸電泳分析Fig.2 Nucleic acid electrophoresis analysis

M-蛋白Marker;1-純化FKP圖3 FKP重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein FKP

2.3 酶學性質

2.3.1 最適反應條件和熱穩定性

在pH 4.5～9.0下研究了FKP的pH曲線(圖4)和pH穩定性(圖5)。當pH值為7.5時，FKP相對酶活性達到最大值，當pH范圍為7.0～7.5和8.5～9.0時，FKP仍表現出80%以上的酶活性。

圖4 FKP 的最適pHFig.4 The optimum pH of FKP

圖5 重組FKP的pH穩定性Fig.5 pH stability of recombinant FKP

從圖6可以看出，FKP最適反應溫度為45 ℃，在35～45 ℃溫度范圍內，可以保留80%以上酶活力。當溫度>50 ℃，酶活力下降較為明顯，說明隨著溫度增加，酶結構受到破壞而失活。熱穩定性是影響酶利用價值的重要因素。在4、12、20、28、37、45 ℃下測量FKP的熱穩定性。當酶在4和12 ℃下孵育3 h時，酶的初始活性保持在90%以上。FKP的活性分別在20、28、37和45 ℃的溫度下暴露40、70、80、100 min后低于60%(圖7)。

圖6 FKP 的最適溫度Fig.6 The optimum temperature of FKP

2.3.2 金屬離子對酶活力的影響

為了研究金屬離子對FKP酶活性的影響，在pH 7.5條件下，測定了在不同二價金屬離子存在下FKP的活性。FKP是一種典型的金屬酶，需要金屬離子來維持其穩定的自然狀態。如圖8所示，當Mg2+的濃度達到2 mmol/L時，Mg2+和Mn2+顯著增加了FKP的活性，并且FKP表現出最高的酶活性。當Mg2+的濃度高于2 mmol/L時，酶活性隨金屬離子濃度的增加而降低。

圖7 重組FKP的熱穩定性Fig.7 Thermal stability of recombinant FKP

圖8 金屬離子對FKP酶活力的影響Fig.8 Effect of metal ions on FKP enzyme activity

2.3.3 反應動力學常數

FKP的穩態動力學常數通過Lineweaver-Burk方法確定。在45 ℃ Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.5)中，在不同底物濃度(0.5～20 mmol/L)下測定重組酶的動力學參數。L-巖藻糖與反應時間(0～10 min)呈線性關系，表明初始反應速率符合一階反應模型。Km和Vmax分別為0.44 mmol/L和0.2 mmol/(min·mg)。以L-巖藻糖為底物的FKP的轉化率(Kcat)和催化效率(Kcat/Km)分別為(31.49±2.5) s-1和(71.57±4.7) s-1/(mmol/L)。

2.3.4 GDP-L-巖藻糖的生物合成

在連續的L-巖藻糖激酶和GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶反應中，重組酶 FKP在以L-巖藻糖、ATP和GTP為起始底物的反應混合物中生產GDP-L-巖藻糖，如圖9所示。在45 ℃下，反應最初1 h，GDP-L-巖藻糖產量迅速增加，1 h后增速變緩，11 h后GDP-L-巖藻糖產量達到最大值2.1 mmol/L。

圖9 不同時間下GDP-L-巖藻糖的生物合成Fig.9 GDP-L-fucose biosynthesis at different times

3 討論

巖藻糖是一種脫氧己糖，存在于多種生物中，參與哺乳動物N-和O-連接糖蛋白和糖脂的修飾[16-17]，巖藻糖基化寡糖涉及真核生物的多種生物學和病理學過程，例如組織發育、血管生成、受精、細胞粘附、炎癥和腫瘤轉移[18]。巖藻糖基化寡糖由巖藻糖基轉移酶構建，這就需要底物GDP-巖藻糖。哺乳動物細胞中GDP-巖藻糖合成的2個途徑：GDP-甘露糖依賴性的從頭途徑和游離巖藻糖依賴性的補救途徑。

本研究中，我們從B.fragilis中克隆得到雙功能酶FKP的基因，并在E.coliBL21 (DE3) 中正確表達，以外源L-巖藻糖為底物，通過兩步反應轉化為GDP-巖藻糖。目前，對于FKP酶學性質研究較少，本文通過比較在不同條件下相對酶活力，得到FKP的最適溫度為45 ℃，在35～45 ℃范圍內能保留80%以上活性。KOTAKE等[7]研究了擬南芥中AtFKGP的酶學性質，對L-巖藻糖激酶和GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶的最適溫度分別進行了測定，發現L-巖藻糖激酶的最佳溫度為40 ℃，在50 ℃下酶活力損失超過99%。而GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶在30～45 ℃范圍內酶活性最大。

本研究中FKP催化L-巖藻糖的最適pH為7.5，根據KOTAKE等[7]對AtFKGP的研究，L-巖藻糖激酶最大活性為pH 10.5，而GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶最大活性在pH 6.5～8.0的范圍?；谏鲜鼋Y果，是由于FKP具有2個不同的L-巖藻糖激酶和GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶活性區域。這2種酶活性的特性不同，所以pH出現了2個峰值，但來自哺乳動物的L-巖藻糖激酶的最佳pH值約為8.0[10,19]，并且因為高pH可能會使GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶活性受到抑制，所以將酶反應體系緩沖至pH 7.5用于酶活力的測定。酶的最佳pH受到活性位點殘基的pKa，酶底物結合和酶表面電荷等各種因素的影響[20]。

金屬離子是另一個影響FKP酶活性的重要因素。不管對于L-巖藻糖激酶還是GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶，二價陽離子在催化反應過程中都是必需的。對于L-巖藻糖激酶活性，Mn2+是比Mg2+更好的陽離子，但與Mg2+相比，它對GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶活性的影響很小，所以在酶反應體系中，通常使用Mg2+作為必需二價陽離子。

在GDP-L-巖藻糖的生物合成中，根據KOTAKE等[7]報道，擬南芥的AtFKGP在40 ℃下反應5 h產物生成量為400 nmol/mL。FKP的低性能可能是由于核苷酸或核苷酸糖抑制了巖藻糖激酶或焦磷酸化酶的活性。以前有報道通過GTP、ADP和GDP抑制豬的煙酰激酶[9-10,21]。因此，我們認為脆弱擬桿菌FKP的L-巖藻糖激酶活性也被GTP(GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶底物)和ADP(L-巖藻糖激酶產物)抑制，這為GDP-L-巖藻糖的生產奠定了基礎。

4 結論

從脆弱擬桿菌中克隆得到雙功能酶FKP的基因，并成功在E.coliBL21 (DE3) 中進行過表達。使用鎳離子親和層析對重組酶分離純化，對純化后的FKP進行了酶學性質分析。重組酶的最適溫度為45 ℃，在低溫下具有良好的穩定性，最適pH為7.5，pH值穩定范圍較寬。Mg2+和Mn2+對FKP的活性具有明顯的激活作用，而Co2+、Fe2+、Cu2+起抑制作用。在一定底物濃度下，GDP-L-巖藻糖產量呈升高趨勢，在轉化11 h后GDP-L-巖藻糖達到最大值2.1 mmol/L。