過表達乙酰-CoA相關基因提高出芽短梗霉liamocins合成能力

鄭鵬，張孟娟，黃思瑤，康新玥，陳葉福*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457) 2(工業發酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學)，天津，300457)

出芽短梗霉為類酵母真菌，由于產生黑色素所以被稱為黑酵母[1]，具有相當重要的生物技術意義、良好的抗環境壓力能力，越來越受到醫學方面的關注。出芽短梗霉因生長環境的不同而具有5種形態：酵母狀細胞、芽孢子、腫脹孢子、菌絲狀細胞和厚垣孢子[2]。出芽短梗霉因可以生產多種胞外酶[3-4]、單細胞蛋白、鐵載體[5]、短梗霉素、普魯蘭糖[6]、聚蘋果酸[7]和重油[8]等多種產物而聞名，并且能應用于生物防治[9]。其中普魯蘭糖是由其合成的一種胞外多糖，它由麥芽三糖以α-(1→6)糖苷鍵反復連接而成，特殊的化學結構賦予普魯蘭糖優良的性質，它黏度大、水溶性極強，在化工、食品、醫藥等行業應用廣泛，可作為增稠劑，也能用于生產可被微生物降解的薄膜，還可作為低卡路里食品直接食用[10]。

Liamocins的生產首先由RUINEN等[11]報道，通過20號和272號出芽短梗霉生產。liamocins這個詞是PRICE等[12]在確定了這個新化合物家族的詳細結構后首次使用的。liamocins由一個部分乙?；亩嘣碱^基團和1～5個3,5-二羥基癸酸酯基尾組成，在第1個3,5-二羥基癸酸中有可能會有3-O-乙?；默F象。而多元醇頭基團的結構和培養基中所用糖的種類無關，主要與菌種[13]和培養基中多元醇種類相關[14]。

Liamocins具有多種商業應用價值，它是比水密度大的油，所以之前一直被稱為重油，顏色多為淺黃、深綠、深棕色；表面張力介于27～31.5 mN/m[8]，可作為商業用表面活性劑使用。多篇報道顯示，liamocins對某些癌細胞具有抗增殖作用[15-16];具有較強的選擇性抗菌能力，對鏈球菌屬有特異性，為出芽短梗霉的一個普遍特性[17];此外，即使受到加熱影響仍能保持抗菌活性[13]。

Liamocins的完全合成途徑至今尚不清楚。在同位素標記的[U-13C]葡萄糖上培養AureobasidiumpullulansNRRL 50380，使用MALDI-TOFMS分析liamocins,在甘露醇部分發現了13C標記，但是在3,5-二羥基癸酸部分并沒有發現[12]。這一信息表明，liamocins的生物合成是相當復雜的。TANG等[18]通過在A.melanogenum9-1中過表達高產聚蘋果酸菌株Aureobasidiumsp. P6的PYC1基因，通過提高檸檬酸的產量來提高liamocins的產量，并推測檸檬酸和乙酰-CoA為liamocins的重要前體物質。值得注意的是，在過表達PYC1的同時，ACL和ME基因的轉錄水平都有不同程度的提高。

本實驗以出芽短梗霉P30為研究對象，通過代謝工程改造出芽短梗霉，過表達乙酰-CoA合酶、ATP-依賴性檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶和丙酮酸羧化酶基因，使胞質乙酰-CoA含量提高，從而來達到高產liamocins的目的。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和引物

AureobasidiumpullulansP30(后文簡稱P30)由本實驗室保藏于-80 ℃冰箱，質粒pUC-AHPT和pUC-GB由本實驗室構建保藏，實驗所用引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 培養基

YEPD培養基(g/L)：酵母浸粉10.0，葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，固體YEPD培養基加入2.0 g/L的瓊脂粉。HCS培養基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母浸粉3.0，牛肉膏1.0，蛋白胨10.0，麥芽浸粉3.0，HCl調至pH 5.7，固體HCS培養基加入2.0 g/L瓊脂粉。HCS雙層培養基：上層為固體HCS培養基，下層固體HCS培養基添加潮霉素B溶液，使終質量濃度為150.0 mg/L。種子培養基(g/L)：木糖20.0，酵母浸粉1.0，K2HPO44.0，(NH4)2SO40.8，MgSO40.2，NaCl 4.0，用HCl調pH至6.0。發酵培養基(g/L)：木糖50.0，酵母浸粉2.0，KNO30.8，NaCl 2.0，K2HPO45.0，MgSO40.3，用HCl調pH至5.5。

1.1.3 酶和試劑

DNA marker、TaqDNA聚合酶、dNTP、Primer Star GXL聚合酶、RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒,TaKaRa中國大連公司；膠回收試劑盒、片段回收試劑盒和質粒提取試劑盒,OMEGE公司；潮霉素B,上海索寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電穿孔儀，美國BTX公司；凝膠成像儀，美國SYN gENE公司；分光光度計，天津普瑞斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組菌株的構建

重組菌株的構建采用GUO等[19]的同源重組依賴性DNA裝配方法。因普魯蘭糖和liamocins均含有大量碳元素，可能存在碳流競爭的關系，所以以編碼普魯蘭糖合成酶基因(PUL1)為整合位點，使碳流更多地流向liamocins的合成。因此，在PUL1位點整合過表達ACS1、ACL、ME、PYC1基因。

1.3.2 培養方法

菌株活化：從甘油管中取10 μL菌液接入裝有5 mL YEPD試管中，28 ℃，200 r/min，培養24 h。

種子培養：從活化的菌液中，取1 mL菌液接入到50 mL/250 mL錐形瓶種子培養基中，28 ℃，200 r/min，培養24 h。

發酵培養：將培養好的種子液3 mL接入到50 mL/250 mL錐形瓶發酵培養基中，28 ℃，240 r/min，培養7 d。

1.3.3 重組菌株生長性能測定

從甘油管中取10 μL P30接種于YEPD液體培養基進行活化，于28 ℃，200 r/min的搖床中培養24 h。取已滅菌的裝液量為50 mL YEPD液體培養基的250 mL三角瓶，加入50 μL活化的菌液，于28 ℃，200 r/min的搖床中培養。每隔4 h取0.5 mL菌懸液，在12 000 r/min的轉速下離心1 min，棄上清液，再用蒸餾水洗滌2次菌體，最后加入2 mL蒸餾水混勻。以蒸餾水為對照，用紫外分光光度計測定OD600值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制出生長曲線。

1.3.4 發酵產物的分析方法

生物量、木糖和胞外普魯蘭糖的測定：根據楊金龍等[20]的方法進行測定。發酵液中liamocins含量測定：根據GUO[19]的方法測定。

1.3.5 mRNA水平的測定

本實驗中所有P30總RNA的提取和反轉錄所用的試劑盒均由TaKaRa公司提供，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。mRNA的水平采用Bio-Rad QX200微滴式數字PCR系統的染料法進行測定。

2 結果和分析

2.1 重組菌株的構建

將上同源臂、下同源臂、潮霉素B抗性、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)啟動子、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAP)終止子和目的基因按照1.3.1方法，轉入P30中，得到疑似轉化子，并進行PCR驗證，得到對應重組菌株。PCR驗證結果如圖1所示。M泳道為DNA marker，1和3泳道為陰性對照，2，4泳道為以重組菌株基因組為模板所得驗證片段，片段大小均符合預期。說明分別過表達ACS1，ACL，ME，PYC1所得到的重組菌株PEACS1、PEACL、PEME、PEPYC1構建成功。對構建成功的過表達菌株進行保藏以便后續研究。

M-DNA marker；1，3泳道-陰性對照；2，4泳道-以重組菌株基因組為模板所得驗證片段圖1 過表達ACS1、ACL、ME、PYC1菌株PCR驗證結果Fig.1 The PCR results of strain overexpression geneACS1, ACL, ME and PYC1

2.2 生長性能測定

將4株改造菌與出發菌株P30分別按照1.3.3方法進行培養，測定生長曲線，如圖2所示。4株重組菌生長趨勢與出發菌基本一致，說明過表達ACS1、ACL、ME和PYC1基因對菌株的生長性能無明顯影響。

圖2 重組菌株生長曲線Fig.2 Growth curve of recombinant strains

2.3 木糖利用能力測定

在發酵培養基中對重組菌株和出發菌株發酵，每24 h測定發酵液中木糖剩余量和生物量，如圖3所示。圖3-a中重組菌株木糖消耗曲線同出發菌株P30基本一致，發酵7 d后發酵液中無木糖殘留，說明重組菌的木糖利用能力沒有受影響。圖3-b中重組菌株總體增長趨勢與出發菌株P30較為一致，但在發酵培養基中培養結束后，PEACL的生物量比出發菌低了19.83%，而在測定生長曲線時，顯示PEACL的生長未受到影響?；蛟S是因為大量的底物轉化為乙酰-CoA從而增強了liamocins合成的同時，導致菌體生長所需營養供應減弱。

a-木糖;b-菌體干重圖3 重組菌株的木糖利用能力Fig.3 Xylose utilization ability of recombinant strains

2.4 重組菌株發酵性能的探究

將重組菌株與原始菌株P30在發酵培養基中發酵，待發酵結束后測定菌體干重、普魯蘭糖和liamocins產量，如圖4所示。

a-干重;b-普魯蘭糖;c-liamocins圖4 重組菌株發酵性能Fig.4 Fermentation performance of recombinant strains

重組菌株的普魯蘭糖產量均低于P30，PEACS1、PEACL、PEME、PEPYC1的普魯蘭糖產量分別降低了12.29%、11.90%、9.37%、13.37%。liamocins的產量較出發株均有所提升，PEACS1、PEACL、PEME、PEPYC1的產量分別比P30高了8.19%、93.74%、13.49%、17.12%。普魯蘭糖的產量略有降低，可能因為一部分碳代謝流向了liamocins的合成。PYC1催化丙酮酸到草酰乙酸的轉化，然后在蘋果酸脫氫酶的催化下將產生的草酰乙酸還原為蘋果酸。當一分子蘋果酸通過線粒體檸檬酸轉運蛋白(citrate transporter, CTP)進入線粒體，同時一分子檸檬酸通過CTP轉移到細胞質中。線粒體中的蘋果酸被轉化為草酰乙酸，其通過三羧酸循環進一步與乙酰-CoA縮合，產生檸檬酸。細胞質中的檸檬酸在ACL的催化下，隨后轉化為乙酰-CoA和草酰乙酸。TANG等[18]在高產liamocins菌株A.melanogenum9-1中異源表達高產聚蘋果酸菌株Aureobasidiumsp. P6的PYC1基因，能明顯提高liamocins產量，但本實驗過表達P30的PYC1后，liamocins產量沒有達到預期效果，還需要進一步研究,找出原因。產油酵母可以積累超過其生物量20%的油脂[21]，而其中關鍵酶為ACL，可催化檸檬酸轉化為乙酰-CoA和草酰乙酸，前者為脂肪酸和liamocins合成的重要前體。本研究也說明過表達ACL可以大幅度提升liamocins的合成。在過表達ACL后，雖然liamocins的產量提升非常明顯，但是生物量和普魯蘭糖的量卻有了較為明顯的降低，或許是由于該基因的過表達，擾動了菌體本身的代謝流，使底物更多流向liamocins合成。ME的過表達并沒有使liamocins的產量明顯提升，或許是因為大量的蘋果酸轉化為丙酮酸，檸檬酸和蘋果酸線粒體穿梭中的蘋果酸供應不足，從線粒體內轉運到細胞質中的乙酰-CoA合成的前體物質檸檬酸減少。ACS可催化乙酸生成乙酰-CoA，而本實驗過表達ACS1后liamocins產量提升幅度并不是很大，或許是因為出芽短梗霉中ACS并不是合成乙酰-CoA的關鍵酶。周丹鳳[22]采用菌株ZUST-GS，利用75.17 g/L的木糖發酵，得到8.41 g/L的liamocins，轉化率為0.11 g/g。LEATHERS等[23]使用菌株A.pullulansNRRL 50384利用120 g/L的蔗糖發酵，得到22 g/L的liamocins，轉化率為0.18 g/g。TANG等[18]使用菌株A.melanogenumM39,利用140 g/L的葡萄糖發酵，得到35.3 g/L的liamocins，轉化率為0.25 g/g。以上分別為出芽短梗霉以木糖、蔗糖、葡萄糖為主要碳源發酵產liamocins的最大產量及liamocins轉化率。PEACL利用50 g/L木糖發酵，得到19.44 g/L的liamocins，轉化率為0.38 g/g。雖然NRRL 50384和M39的liamocins產量高于PEACL，但轉化率均較低，PEACL的liamocins的產量和轉化率均優于ZUST-GS。

2.5 過表達基因轉錄水平測定

分別提取出發菌株和重組菌株的RNA，并選取3-磷酸-甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內參進行微滴式數字PCR反應。分別對每株重組菌株對應基因的轉錄水平進行定量分析，如圖5所示。重組菌株的相應基因的轉錄水平都有所升高，進一步驗證了所有過表達菌株均構建成功，但結果顯示，各個基因的轉錄水平提高程度不盡相同。過表達ACS1、ACL、ME、PYC1基因菌株的轉錄水平分別提高了8.16、0.94、14.78和12.17倍。值得注意的是，雖然PEACL對應基因的轉錄水平提高較低，但從發酵結果來看，其liamocins產量的提升幅度非常高，遠大于過表達其他基因的菌株，這表明出發株P30的liamocins合成或許受到ACL的轉錄水平限制，而ACL為P30合成liamocins的關鍵酶。

圖5 重組菌株對應基因相對轉錄水平Fig.5 Relative transcription level of the corresponding gene of the recombinant strain

3 結論

本研究分別過表達乙酰-CoA合成相關基因ACS1、ACL、ME、PYC1，成功構建了重組菌株PEACS1、PEACL、PEME和PEPYC1。結果發現，重組菌株的liamocins產量都有不同程度的提高，效果最明顯的是過表達ACL，雖然該基因過表達后其轉錄水平提升幅度不大，但liamocins產量提高了93.74%，這說明過表達該基因能明顯地促進liamocins合成，并且該基因為P30合成liamocins的關鍵基因，其合成liamocins的能力或許受ACL轉錄水平的限制。以上結果說明，強化乙酰-CoA合成可以提高liamocins產量，而其中的ACL基因對出芽短梗霉liamocins的合成至關重要。