短雙歧桿菌凍干保護劑的優(yōu)選及高密度凍干工藝優(yōu)化

蔣文鑫，崔樹茂，毛丙永，唐鑫，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

2001年，世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為“當攝入足夠的數(shù)量，給宿主帶來健康益處的活微生物”[1]。雙歧桿菌屬是具有益生菌特征的主要種屬之一，臨床研究證明雙歧桿菌是最有益的腸道微生物[2-3]。短雙歧桿菌是益生菌產品中常用的雙歧桿菌之一，它具有預防和治療兒科疾病，增強免疫，改善皮膚，預防肥胖等多種益生功能[4-6]。

為了增強益生菌的長期穩(wěn)定性，必須將其保存在水分大量減少的干燥狀態(tài)。因此，制備益生菌菌粉是首選方法，其干燥方式包括噴霧干燥、冷凍干燥、真空干燥和流化床干燥[7]。其中真空冷凍干燥，也稱作冷凍干燥，是將物料凍結到共晶點溫度以下，在低壓狀態(tài)下，通過升華除去物料中水分的一種干燥方法[8]，是近幾十年來最方便，應用最廣泛，可提高益生菌貯存穩(wěn)定性的除水方法之一。與其他干燥方法相比，真空冷凍干燥技術的優(yōu)點更為突出：低溫操作使各種成分的活性喪失少；菌種的形態(tài)得以保持；復水性好，能較快還原成干燥前的鮮活狀態(tài)；脫水徹底，易于保藏與運輸，銷售方便[9]。目前，雙歧桿菌菌粉的制備主要采用真空冷凍干燥法。但是，雙歧桿菌在凍干過程中仍可能受到多種損傷，如機械損傷、溶質損傷、膜損傷、蛋白質變性(包括酶變性)和DNA損傷等，加入保護劑是降低凍干對菌株損傷的最佳策略之一[7,10-13]。目前文獻中報道的雙歧桿菌凍干保護劑主要有糖類、蛋白類和其他類小分子物質，比較常見的保護劑為蔗糖、海藻糖、甘露醇、脫脂乳粉、抗壞血酸、微量元素等[4,7]。由于雙歧桿菌的耐受能力較差，現(xiàn)有的凍干保護劑效果都不好，凍干保護機理尚不明確。因此本文針對短雙歧桿菌所適用的凍干保護劑進行系統(tǒng)的分析及優(yōu)化，進而為雙歧桿菌的凍干保護提供思路。

目前雙歧桿菌的工業(yè)化生產效率較低，且真空冷凍干燥是一個高能耗的過程。因此，如何降低能耗，提高每次凍干的產量是工業(yè)化生產中面臨的極大挑戰(zhàn)。針對這種挑戰(zhàn)，在凍干前提高樣品的濃度，可以減小凍干體積，提高單位凍干面積的產量，即高密度凍干，從而降低工作能耗。但是，如何在保證凍干存活率的條件下提高樣品的濃度，是實現(xiàn)雙歧桿菌高密度凍干的難點。本研究在實驗所得的短雙歧桿菌最佳凍干保護配方的基礎上，優(yōu)化凍干前樣品的干物質配比及質量分數(shù)，進而獲得最佳的高密度凍干方案，實現(xiàn)降低能耗的目的。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株

短雙歧桿菌CCFM 683(BifidobacteriumbreveCCFM 683)，由江南大學食品生物技術中心保藏。

1.1.2 試劑

MRS-L培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，吐溫80 1 mL，K2HPO42.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，MnSO4·7H2O 0.05 g，半胱氨酸磷酸鹽1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，115 ℃滅菌20 min，原料均購自國藥集團。

半胱氨酸磷酸鹽緩沖液(Cys緩沖液)：L-半胱氨酸磷酸鹽0.5 g，KH2PO46.0 g，Na2HPO44.5 g，NaCl 4.0 g，吐溫80 0.6 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8～7.0，115 ℃滅菌20 min，原料均購自國藥集團。

保護劑：海藻糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖、山梨糖醇等試劑,均購自創(chuàng)賽生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AW500SG-7152厭氧工作站，英國依萊泰科公司；FE20 pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；EL3002電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS-3-basic渦旋振蕩器，德國IKA公司；MLS-3750高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；LYOBETA-5PS凍干機，西班牙Telstar公司；RC-BIOS10落地式離心機，賽默飛世爾公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)

用接種環(huán)蘸取保菌管中的菌液在MRS-L平板上劃線，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落至MRS-L液體試管中，置于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)18～22 h。將菌液以體積分數(shù)為5%的接種量連續(xù)活化3次后，獲取菌株培養(yǎng)液用于試驗。

1.3.2 短雙歧桿菌的凍干

以體積分數(shù)為5%的接種量接菌至MRS-L培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)18～22 h后，8 000×g， 4 ℃，離心15 min，棄去上清液。將菌泥與無菌生理鹽水以質量比1∶1混勻后，調節(jié)pH至6.5左右制得菌懸液，再將菌懸液與保護劑溶液以體積比2∶1混合，充分混勻后吸取1 mL分裝至凍干瓶凍干。

凍干工藝：預凍，控制層板1 h內降溫至-50 ℃，保持4 h；一次干燥，控制層板1.3 h升溫至-30 ℃，保持30 h；二次干燥，控制層板1 h升溫至25 ℃，保持20 h。

1.3.3 保護劑溶液的配制

1.3.3.1 單一保護劑溶液的配制

分別稱取定量的糖(醇)類、蛋白類等各種保護劑，加入定量的水溶解，制得質量濃度為200 g/L的保護劑溶液。

1.3.3.2 復合保護劑溶液的配制

復合保護劑中各組分按比例復配，維持保護劑溶液的質量濃度恒為200 g/L。

(1)糖類復合保護劑溶液

保護劑A(2種保護劑質量比1∶1復配)：將2種糖類復配且兩者質量比為1∶1，即每種糖的質量濃度為100 g/L。

保護劑B(3種保護劑質量比1∶1∶1復配)：將3種糖類復配且3者質量比為1∶1∶1，即每種糖的質量濃度為67 g/L。

(2)糖類復合蛋白類保護劑溶液

保護劑C(糖類與蛋白類質量比為1∶1)：最優(yōu)糖類保護劑100 g/L，蛋白類100 g/L。

保護劑D(糖類與蛋白類質量比為3∶1)：最優(yōu)糖類保護劑150 g/L，蛋白類50 g/L。

(3)最優(yōu)復合保護劑復配其他小分子類保護劑

前面優(yōu)化得到的最優(yōu)復合保護劑分別添加MnSO410 g/L、MgSO420 g/L，抗壞血酸30 g/L，谷胱甘肽15 g/L，L-酪氨酸15 g/L，甜菜堿0.4 g/L，復合保護劑溶液的總質量濃度為200 g/L。

1.3.4 短雙歧桿菌的高密度凍干

稱取定量的菌泥置于烘箱中烘干，稱量干燥后的物質質量，換算可得每克菌泥中的干物質含量。稱取定量的菌泥與保護劑，按照菌泥干物質與保護劑1∶1、1∶1.2的質量比，分別配制質量分數(shù)為15%、20%、25%的樣品，充分混勻后吸取1 mL分裝至凍干瓶凍干，凍干工藝同1.3.2。

1.3.5 活菌計數(shù)[14-15]

1.3.5.1 凍干前活菌計數(shù)

吸取0.5 mL凍干前樣品至4.5 mL Cys緩沖液中進行10倍稀釋，重復以上步驟，稀釋至合適梯度。吸取1 mL稀釋后的樣品于無菌平板中，傾注適量的MRS-L固體培養(yǎng)基混合均勻，每個稀釋度做3個平行，待凝固后倒置于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h。

1.3.5.2 凍干后活菌計數(shù)

在凍干后的樣品中加入定量的無菌水，使其復水至凍干前的質量，活菌計數(shù)操作同凍干前。

1.3.6 凍干存活率的測定[16]

(1)

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

每組實驗做3個平行，使用SPSS Statistics 26.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對實驗結果進行ANOVA判斷(Tukey’s檢驗)，P<0.05認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同種類凍干保護劑的保護特性

依據(jù)已有的文獻報道，凍干保護劑按照滲透性分為可滲透類、半滲透類和不滲透類3種[9,17]：甘油等可滲透化合物使細胞膜更具可塑性，并與水結合，從而抑制過度脫水，防止細胞在冷凍過程中形成冰晶[18]；小分子糖等半滲透化合物在冷凍前誘導細胞的質壁分離，并集中在細胞膜和細胞壁之間作為冰生長的緩沖層，與細胞膜磷脂和蛋白質極性基團形成氫鍵相互作用，代替極性基團周圍失去的氫鍵結合水，為膜提供機械保護[19]；大分子糖及蛋白質等不滲透化合物吸附在細胞表面，形成一個保護層，通過增加溶液黏度來抑制冰的生長速度，同時減少與氧的接觸[9,20]。目前關于雙歧桿菌凍干保護劑的文獻多為少數(shù)幾種保護劑之間的對比，沒有系統(tǒng)地分析雙歧桿菌凍干保護劑之間的差異。本試驗將文獻報道中常見的糖(醇)類、蛋白類保護劑按照不同的分子質量進行分類，以凍干后活菌數(shù)和存活率為依據(jù)，系統(tǒng)分析不同結構不同分子質量不同性質的保護劑對短雙歧桿菌的凍干保護差異。

由表1可知，與空白對照組相比，除赤蘚糖醇的凍干存活率為(1.27±0.57)%，其余保護劑的凍干存活率均有所提高。糖(醇)類保護劑的凍干存活率普遍高于蛋白類凍干保護劑，且結構大小低于三糖的小分子糖對短雙歧桿菌的凍干保護效果較好。其中，棉子糖的凍干存活率最高，為(53.22±3.55)%，山梨糖醇的存活率僅次于棉子糖，凍干存活率為(46.13±5.55)%。

2.2 糖類復合保護劑的保護效果

山梨糖醇被用作凍干保護劑的研究較多，其保護機理[20-22]主要有：(I)替代水并與膜磷脂中的磷酸基團相互作用；(II)提供高的滲透應力，高滲透脅迫誘導熱休克蛋白基因表達，熱休克蛋白可維持膜結合酶

表1 短雙歧桿菌在不同種類保護劑中的凍干存活率Table 1 The freeze-drying survival rate ofB.breve in different protectants

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

和膜的完整性；(III)穩(wěn)定蛋白質結構，形成山梨醇蛋白復合物；(IV) 抗氧化特性可防止脂質氧化。棉子糖作為三糖，含有多個羥基，在凍干過程中除去水后，棉子糖的羥基基團可以代替水分子，細胞膜的極性頭通過氫鍵與棉子糖的羥基直接相互作用，從而減少菌體在凍干過程中受到的損傷[7]。另外，ACHMAD等[23]研究發(fā)現(xiàn)，短雙歧桿菌在棉子糖上的生長要優(yōu)于其他測試的可發(fā)酵糖。作為可被高效利用的三糖，棉子糖亦有可能在與菌體混合時被快速轉運至胞內進行積累，在胞內、胞外同時保護菌體減少凍干損傷。綜合討論，山梨糖醇與棉子糖除了共同的保護機制外，還有其他不同的潛在提高凍干保護的機制，因此將二者進行復配，研究其對短雙歧桿菌的凍干保護效果。

通過試驗發(fā)現(xiàn)(圖1)，山梨糖醇與棉子糖復配后，相較于單一保護劑，凍干存活率有顯著性提高。這說明山梨糖醇與棉子糖的保護機理確有不同之處。將山梨糖醇與棉子糖復配后作為凍干保護劑，2者可以從多方面保護短雙歧桿菌，進一步提高單一保護劑的凍干保護效果。綜合以上因素，我們將山梨糖醇和棉子糖作為與蛋白類復配的優(yōu)勢保護劑。

圖1 短雙歧桿菌在糖類復合保護劑中的凍干存活率Fig.1 Freeze-drying survival rate of B. breve in carbohydrate compound protectant注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 復配蛋白類保護劑的保護效果

蛋白質與糖類的不同性質會產生不同的保護特性。小分子糖作為一種半透膜化合物，可在細胞膜和細胞壁之間聚集。而蛋白質作為一種非滲透性化合物，主要吸附在細胞表面[20]。如脫脂乳，在細胞與蛋白之間的疏水相互作用過程中，在細胞表面形成一層保護層，從而保護細胞[24]。雖然蛋白類物質作為單一保護劑時，保護效果并不好(表1)，但是基于其與糖類保護劑具有不同的保護機理，將糖類和蛋白類保護劑進行復配時，可能會從多方面保護雙歧桿菌，從而提高菌株的存活率。同時，蛋白類保護劑不僅可以在凍干過程中為細胞提供保護層，還可以使凍干產品形成多孔結構，使復水更容易，更利于應用于生產當中[20]。因此，我們將糖類復合保護劑與蛋白類物質按照不同比例復配，考察糖類保護劑與蛋白類保護劑復配是否會提高對菌體的凍干保護效果。

由圖2可知，添加蛋白并沒有像預期的那樣提高雙歧桿菌的凍干保護效果，但少量添加蛋白類物質可確保糖類復合保護劑保護效果不會降低(4組和5組沒有顯著差異)。但是若只添加糖類保護劑，凍干后的樣品質地較硬且不易粉碎成粉劑，而添加一定比例的蛋白可提高菌粉的疏松度，更利于凍干粉劑的成型。綜合考慮，將糖類復合保護劑與膠原蛋白以質量比3∶1復配后的保護劑作為優(yōu)勢保護劑，進一步研究與其他小分子物質復配后對短雙歧桿菌的凍干保護效果。

1-m(山梨糖醇+棉子糖)∶m(乳清蛋白)=1∶1；2-m(山梨糖醇+棉子糖)∶m(乳清蛋白)=3∶1；3-m(山梨糖醇+棉子糖)∶m(膠原蛋白)=1∶1；4-m(山梨糖醇+棉子糖)∶m(膠原蛋白)=3∶1；5-山梨糖醇+棉子糖；6-膠原蛋白；7-乳清蛋白圖2 短雙歧桿菌在復配蛋白類保護劑中的凍干存活率Fig.2 Freeze-drying survival rate of B. breve inthe compound of protein protectants

2.4 復配其他小分子對菌株的凍干保護效果

除了糖(醇)類、蛋白類物質可提高菌株的凍干存活率外，也有其他小分子對菌株的凍干保護效果的報道。例如，抗壞血酸等抗氧化劑可能延緩膜磷脂的自氧化作用[25]；甜菜堿可以在干燥過程中穩(wěn)定蛋白質和細胞膜在滲透脅迫條件下造成的低水分活度[26]；L-酪氨酸等氨基酸可以進入細胞內，起到胞內緩沖作用[20]；谷胱甘肽能夠保護菌株在冷凍脅迫過程中的細胞完整性和平滑度并提高細胞膜不飽和脂肪酸成分的比例[27]；MnSO4作為緩沖鹽，能夠滲透到細胞內部從而調節(jié)菌體內部理化平衡，同時可與其他保護劑產生聯(lián)合作用[28]。因此，我們將這幾種小分子物質與前期確定的復合保護劑進行復配，進一步驗證這些物質是否會優(yōu)化已有配方的凍干保護效果。

由圖3可知，這些小分子物質并沒有像文獻中報道的那樣顯示出提高復合保護劑的凍干保護效果。相較于不添加小分子物質的對照組，除了加入MnSO4和MgSO4的保護劑組別凍干存活率有所降低，其他組別的凍干存活率與對照組沒有顯著差別。說明這些物質在短雙歧桿菌的凍干過程中并無明顯保護效果。

1-復合保護劑+硫酸錳+硫酸鎂；2-復合保護劑+抗壞血酸；3-復合保護劑+谷胱甘肽；4-復合保護劑+L-酪氨酸；5-復合保護劑+甜菜堿；6-復合保護劑圖3 短雙歧桿菌在復配其他小分子中的凍干存活率Fig.3 Freeze-drying survival rate of B. breve in the compound of other small molecules

2.5 短雙歧桿菌的高密度凍干優(yōu)化

隨著人們對雙歧桿菌功能的深入了解，雙歧桿菌已經具有越來越多的商業(yè)價值。如何提高產量、降低能耗便是眾多企業(yè)的關注焦點。目前的研究多為從菌株高密度培養(yǎng)進行探究，鮮有從樣品濃度方面探究如何降低生產成本。菌泥與保護劑的配比、凍干樣品的干物質含量是實現(xiàn)高密度凍干的關鍵因素。因此，本試驗設定了幾組不同的干物質比例與質量分數(shù)，研究不同方案的凍干效果。

由表2可見，菌泥干物質與保護劑的質量比為1∶1.2，樣品干物質總質量分數(shù)為25%時，短雙歧桿菌的凍干存活率最高。這說明，當保護劑比菌泥干物質多時，每個活菌體被保護劑保護的程度更高。該種方案下，保護劑由山梨糖醇、棉子糖與膠原蛋白以質量比3∶3∶2組成。相較于目前工廠常用的15%～20%的干物質質量分數(shù)，該方案提高了每次凍干機運行的產量，降低了同生產量的能耗。短雙歧桿菌的凍干存活率接近80%，凍干粉活菌數(shù)高達16 100億，即(1.61±0.27)×1012CFU/g。

表2 短雙歧桿菌在高密度凍干中的存活率Table 2 High density freeze-drying survival rate ofB. breve

3 結論

(1)糖(醇)類保護劑的凍干存活率普遍高于蛋白類保護劑，三糖及以下的小分子糖對短雙歧桿菌的凍干保護效果較好，棉子糖和山梨糖醇的凍干保護效果最好。

(2)棉子糖與山梨糖醇復配后會進一步提高單一保護劑的凍干保護效果。

(3)添加蛋白類物質不會增強糖類物質對短雙歧桿菌的凍干保護效果，但適量添加可提高菌粉的疏松度。

(4)復合保護劑中添加MgSO4、MnSO4、谷胱甘肽、抗壞血酸、L-酪氨酸、甜菜堿不會顯著提升保護劑對短雙歧桿菌的凍干保護效果。

(5)保護劑由山梨糖醇、棉子糖與膠原蛋白以質量比3∶3∶2組成，菌泥干物質與保護劑的質量比為1∶1.2，樣品干物質總質量分數(shù)為25%時，短雙歧桿菌的凍干存活率接近80%，凍干粉活菌數(shù)高達 16 100億，即(1.61±0.27)×1012CFU/g。