靈芝孢子粉低聚糖的制備及調節腸道菌群功能研究

楊開，張雅杰，張酥，蔡銘，皮雄娥，胡君榮，關榮發，孫培龍*

1(浙江工業大學 食品科學與工程學院，浙江 杭州，310014) 2(寧波薈康生命科技有限公司，浙江 奉化，315500) 3(浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，浙江 杭州，310021) 4(杭州娃哈哈科技有限公司研發中心，浙江 杭州，310018)

靈芝(Ganodermalucidum)為多孔菌科真菌，廣泛分布于日本、韓國、中國等地區，又被稱為林中靈、仙草等[1-2]，為我國傳統名貴滋補品[3]。靈芝可以防治心血管、神經性、免疫性和癌癥等疾病[4-5]。靈芝孢子粉是靈芝的生殖細胞，其孢子內幾乎含有靈芝的所有營養及活性物質，如糖類、甾醇類、萜類和微量元素等[6]，其中多糖類物質是主要活性成分之一。

正常人體內存在著大量寄生菌群，主要在腸道中定植，與宿主形成共生關系，并在新陳代謝和免疫系統中起重要作用[7]。人體腸道內微生物包括有益菌、有害菌和中性菌[8]，其中有益菌的益生作用主要是通過直接或者間接調整宿主腸道微生物的組成，激活宿主內源性微生物群或免疫系統的活性來實現[9]。低聚糖作為一種新型的功能性糖源已被廣泛用于保健品、飲料等食品領域，其不能被胃酸降解，但可以作為益生元被腸道中有益菌群利用，產生短鏈脂肪酸從而調節腸道環境[10]。胡麗萍[11]通過羧甲基化改性獲得羧甲基靈芝孢子粉，再經酶降解獲得羧甲基靈芝孢子低聚糖，研究發現其能促進雙歧桿菌的增殖。但此法需要化學改性及酶法降解，食用安全性及制備成本較高。因此，有必要對靈芝孢子粉，尤其是其多糖提取時的低聚糖副產物進行直接回收利用。

本文以靈芝孢子粉為原料，以常規水提-醇沉工藝提取副產物中的靈芝孢子粉低聚糖，采用腸道微生態體外發酵模型，探究靈芝孢子粉低聚糖對腸道菌群的影響，并通過代謝產物中短鏈脂肪酸與產氣的變化、靈芝孢子粉低聚糖的利用情況以及菌群結構變化，進一步闡述靈芝孢子粉低聚糖對于腸道菌群的調節功能。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

未破壁靈芝孢子粉、破壁靈芝孢子粉，均由浙江壽仙谷醫藥股份有限公司提供。

主要試劑：乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、巴豆酸標準品、3，5-二羥基甲苯，阿拉丁生化科技股份有限公司；正丁醇、甲酸、偏磷酸、K2HPO4、蛋白胨等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；AB-8大孔樹脂、100～500 Da透析袋，上海源葉生物科技有限公司；Q328520 DNA抽提試劑盒，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Takara ExTaq，寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.2 儀器與設備

HALO-F100自動糞便分析處理儀，蘇州海路生物技術有限公司；GC2010氣相色譜儀，日本Shimadzu 公司；2695凝膠色譜儀，美國沃特世公司；多成分氣體測定儀，杭州海路醫療科技有限公司；XS105分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；580BR10905 PCR儀，美國伯樂公司；HE-120電泳儀，上海天能科技有限公司；-80 ℃冰箱，美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 靈芝孢子粉低聚糖的制備

分別取200 g未破壁(U-GLS)、破壁靈芝孢子粉(B-GLS)→加入體積分數為95%乙醇浸泡24 h→5 000 r/min離心，取沉淀物→室溫風干→加入1∶15(質量比)蒸餾水95 ℃浸提3次，每次3 h→離心取上清液→旋轉蒸發濃縮→加入無水乙醇使乙醇終體積分數為80%→靜置12 h→8 000 r/min，4 ℃離心得靈芝孢子粉多糖提取物，取上清液→旋轉蒸發濃縮→過AB-8大孔樹脂脫除色素等雜質→蒸餾水洗脫液100～500 Da透析袋透析48 h→透析袋中料液經旋轉蒸發濃縮→冷凍干燥48 h→靈芝孢子粉低聚糖(UGLS-O、BGLS-O)[12]。

1.3.2 分子質量及成分含量測定

采用凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography, GPC)法測定UGLS-O和BGLS-O 的相對分子質量。用一系列聚乙二醇標準物校準分子質量，通過將保留時間與標準曲線進行比較來確定樣品的分子質量。流動相為0.1 mol/L的KNO3水溶液，凝膠柱為WATERS Ultrahydrogel 500 column (7.8 mm×300 mm)、WATERS Ultrahydrogel 250 column (7.8 mm×300 mm)和WATERS Ultrahydrogel 120 column (7.8 mm×300 mm)串聯合用，流速為1.0 mL/min，Agilent 1260示差檢測器，柱溫為40 ℃。

利用苯酚-硫酸法[13]、考馬斯亮藍[14]、福林酚法[15]分別測定總糖、蛋白質、酚類含量。

1.3.3 體外發酵實驗

1.3.3.1 培養基配制

YCFA基礎培養基：KH2PO40.45 g/L，K2HPO40.45 g/L，NaCl 0.05 g/L，CaCl·2H2O 0.064 g/L，MgSO4·7H2O 0.09 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物2.5 g/L，L-半胱氨酸1 g/L，血紅素2 mL/L，維生素Ⅰ200 μL /L。

實驗培養基：分別以UGLS-O和BGLS-O為唯一碳源(8 g/L)加入到基礎培養基中，空白培養基中不加糖源。調節pH至6.5，在厭氧條件下，以5 mL為單位分別加入到10 mL發酵瓶中。高壓滅菌，配制成UGLS-O培養基、BGLS-O培養基、空白培養基備用。

1.3.3.2 人體糞便液的批量發酵

稱取0.8 g健康成人糞便(5男5女，年齡20～30歲，要求至少3個月內未服用過抗生素；糞便常溫下密封保存，在2 h內進行發酵實驗)，置于自動糞便處理機中，加入8 mL PBS緩沖液，配制成100 g/L的糞便稀釋液。取500 μL懸浮液分別接種于空白培養基、UGLS-O培養基和BGLS-O培養基中，搖勻后在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，在0、24 h時分別取樣1 mL進行相關檢測分析。

1.3.4 薄層層析法檢測低聚糖的利用情況

(1)展開劑：V(水)∶V(正丁醇)∶V(甲酸)=1∶4∶5配制，然后混合均勻。

(2)顯色劑：900 mg 3,5-二羥基甲苯(地衣酚)溶于25 mL水中，然后加入375 mL乙醇，在冰浴條件下緩緩加入50 mL濃H2SO4。

吸取0.2 μL各時間點(0、24 h)的糞便發酵樣品點樣于硅膠板上，傾斜放置于層析缸中，待展開劑到達硅膠板頂端時，取出吹干，然后放入顯色劑中浸潤，然后拿出吹干，放入烘箱中顯色[15]。

1.3.5 短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)測定

根據吳琴琴[16]的方法配制巴豆酸-偏磷酸溶液。對發酵0、24 h時留存的樣品進行離心，取上清液，并加入巴豆酸-偏磷酸溶液酸化反應24 h。離心后吸取上清液過0.22 μm水相濾膜。

采用氣相色譜(GC)法，根據標準品的保留時間及峰面積的測定樣品中短鏈脂肪酸的總量及各組分含量[17]。毛細管柱：DB-FFAP，30 m×0.53 mm×0.5 μm，進樣量為1.0 μL[18]。

1.3.6 氣壓測定與氣體分析

糞便稀釋液接入培養基后進行排氣，使其氣壓與大氣壓等同。發酵24 h后，利用自動氣體分析儀測定發酵瓶內氣壓值(kPa)與各氣體含量[19]。

1.3.7 發酵液中菌群結構變化分析

取等量發酵液離心后棄去上清液，沉淀保存在-80 ℃冰箱中。利用DNA抽提試劑盒對樣本DNA進行提取，之后再利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。然后取適量的樣品于離心管中，用無菌水稀釋樣品至 1 ng/μL，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物、ExTaq高保真酶進行PCR擴增及測序。然后構建文庫，選取合格的文庫進行制備和測序，得到的數據進行相應的生物信息分析[16]。

1.4 數據處理

每組數據平行測定3次，以平均值±偏差(Mean±SD)表示，使用SPSS 19.0進行方差和顯著性分析，利用GraphPad prism 8進行軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 靈芝孢子粉低聚糖的分子質量分布及主要成分分析

由表1可知，UGLS-O、BGLS-O的得率分別為(1.28±0.53)%、(1.54±0.27)%。UGLS-O、BGLS-O分別由2個組分構成，分子質量分別為509、904 Da和514、945 Da。主要成分分析見表1。結果表明，利用此制備方法可獲得純度高達80%的靈芝孢子粉低聚糖。

表1 靈芝孢子粉低聚糖分子質量分布及基本成分Table 1 Molecular weight distribution and basiccomponents of GLS oligosaccharides

2.2 腸道菌群對靈芝孢子粉低聚糖的降解

本實驗通過腸道微生物體外發酵模型研究健康人體的腸道微生物對UGLS-O和BGLS-O的發酵性能。利用TLC快速直觀地觀察靈芝孢子粉低聚糖(UGLS-O、BGLS-O)被腸道菌群的利用情況。

首先對2種低聚糖的組成成分進行分析，由圖1可知，UGLS-O和BGLS-O在TLC板上呈現2個點，表明其含有2個不同的寡糖組分。從10位志愿者利用降解UGLS-O和BGLS-O的情況來看，不同性別個體之間存在較大差異，且相同性別個體間也存在較大差異。對于女性志愿者，發酵24 h后，利用TLC未能檢測到w5號樣本發酵產物中的寡糖，說明其能很好地降解靈芝孢子粉低聚糖，而其他女性樣本的發酵產物中存在少量未降解組分。對于男性志愿者，發酵24 h后，m4號和m5號樣本的發酵產物中存在極少量較大組分的寡糖，而其他男性樣本發酵產物中均未檢測到寡糖。以上結果說明腸道菌群能夠很好地利用靈芝孢子粉低聚糖(UGLS-O、BGLS-O)，但其受個體差異影響較大，男性相對女性具有更強的靈芝孢子粉寡糖利用能力。

圖1 十位志愿者腸道微生物對UGLS-O和BGLS-O的利用及降解情況TLC分析Fig.1 UGLS-O and BGLS-O utilization and degradation patterns of 10 human (5 man, 5 woman) fecal microbiome analyzed by TLC

2.3 發酵前后短鏈脂肪酸含量分析

短鏈脂肪酸是腸道微生物主要的代謝產物，主要因厭氧微生物發酵難消化碳水化合物而產生。它們可被腸道黏膜有效吸收利用，可作為基因表達的調節劑和被特定受體識別的信號分子，從而對宿主產生重要影響[20]。已有研究表明它與人類某些病理狀況(如炎癥腸病和腸易激綜合癥)和細胞免疫發育之間存在直接聯系，且碳水化合物底物的不同，發酵產生的短鏈脂肪酸的比例和生理作用也不同[16]。其中乙酸、丙酸、丁酸是腸道菌群發酵的主要短鏈脂肪酸代謝產物。

通過氣相色譜分析糞便樣品與發酵液中短鏈脂肪酸含量。以性別為單元進行分析，由圖2-A可知，不同性別的糞便原樣中，男女之間短鏈脂肪酸總含量存在顯著性差異。

a-男女之間短鏈脂肪酸總含量差異；b-性別個體之間同種短鏈脂肪酸差異圖2 發酵前糞便中的短鏈脂肪酸含量Fig.2 The SCFA concentrations in the feces before fermentation注：*P<0.05，**P<0.01(下同)

對糞便原樣中不同種類短鏈脂肪酸含量進行分析，由圖2-B可知，對于同一種短鏈脂肪酸，不同性別個體間存在顯著性差異。

比較不同性別的糞便樣本在不同培養基中發酵后的短鏈脂肪酸含量，由圖3-A可知，與空白對照組相比，添加不同種類低聚糖的培養基經體外發酵后短鏈脂肪酸總含量均得到了不同程度的提高，且男士相對女士具有較大的增長。對不同種類脂肪酸含量進行分析，由圖3-B可知，乙酸是發酵的主要代謝產物，可作為合成膽固醇的重要底物。與空白對照相比，發酵24 h后，不同培養基乙酸含量均顯著升高，其中男性高于女性樣本。體外實驗表明，丙酸含量的增加能夠抑制膽固醇的合成，抑制癌細胞增長。由圖3-C可知，與空白對照相比，發酵24 h后，UGLS-O和BGLS-O均能顯著提高丙酸含量，但不同性別個體之間無明顯差異。丁酸是腸上皮細胞的主要能量來源，由圖3-D可知，與空白對照組相比，UGLS-O和BGLS-O在發酵24 h后均能增加丁酸含量。

以上結果表明，UGLS-O和BGLS-O與其他已報道的具有益生效果的低聚糖，如低聚果糖、低聚半乳糖等[21]一樣，均能夠增加SCFA產量，從而改善腸道菌群，促進有益菌增長，減少致癌物的產生。

2.4 腸道微生物產氣分析

腸道菌群在代謝蛋白質、碳水化合物產生SCFA的同時，也會產生CO2、H2、CH4、H2S等氣體，它是腸道微生物代謝活動的副產物[22]。這些氣體可直接或間接影響腸道狀態，并影響人體健康，如適量氣體有利于糞便膨脹以及排泄，但過多的氣體則會引起腹脹等疾病，所以腸道氣體可作為評估胃腸功能和許多受胃腸功能影響的疾病治療效果的標志物[23]。

圖3 糞便微生物在含不同培養基中發酵后短鏈脂肪酸含量Fig.3 The SCFA productions of fecal microorganisms after different media fermentation

由圖4可知，與空白對照組相比，體外發酵24 h后，UGLS-O和BGLS-O的氣壓值均稍有增加，但各培養基之間的氣壓值卻無顯著變化。因此UGLS-O和BGLS-O提取物對發酵過程中的產氣量影響較小，不會引起腹脹等。

圖4 體外發酵24 h腸道菌群產氣氣壓值Fig.4 Pressure value after 24 h of in vitro fermentation

2.5 靈芝孢子粉低聚糖對腸道菌群結構的影響

2.5.1 稀釋曲線

不同培養基發酵液中微生物稀釋性曲線見圖5，圖5中1條曲線代表1個樣本，橫坐標為隨機抽樣的深度(即抽樣的序列數)，縱坐標為指數數值。從圖5中可以看出各個樣品的稀釋曲線隨著抽樣序列數的增加而趨于平坦，此結果說明測序深度足夠大，可以反映出樣本中絕大多數微生物的多樣性信息[24]。

A-稀釋曲線圖;B-Shannon曲線圖圖5 測序深度圖Fig.5 Sequencing depth

2.5.2 發酵液中腸道菌群構成

選取相對豐度前15的細菌，進行屬水平相對豐度的比較(圖6)。由圖6可知，發酵24 h后，與空白對照相比，添加靈芝孢子粉低聚糖的實驗組中普雷沃菌屬(Prevotella)、糞棲桿菌屬(Faecalibacterium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)等有益菌的相對豐度更高，而大腸桿菌屬(Escherichia_shigella)的相對豐度有所降低。研究表明普雷沃菌屬(Prevotella)豐度的增加可以改善人體的糖代謝機能，并且提升糖原的儲存能力[25]。糞棲桿菌屬(Faecalibacterium)在結腸中會產生丁酸和CO2，這對IBD和抑制肥胖均有潛在益處[26-27]。雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)是腸道細菌中典型的厭氧益生菌，研究表明以其為代表的益生菌可降低膽固醇、抗腫瘤、延緩衰老、抗菌消炎、抑制致病菌粘附、通便等活性[28]。

圖6 腸道微生物群落屬水平柱形圖Fig.6 Gut microbiologic community bar chart on genus level

3 結論

對水提醇沉法提取破壁和未破壁靈芝孢子粉多糖時的上清液副產物進行低聚糖回收利用，經AB-8大孔樹脂除雜和100～500 Da透析袋透析，獲得了純度約為80%的2種靈芝孢子粉低聚糖。通過體外發酵實驗研究了2種低聚糖對腸道菌群的影響，發現腸道菌群能夠有效利用靈芝孢子粉低聚糖。此外，與空白對照相比，添加靈芝孢子粉低聚糖能提高腸道菌群短鏈脂肪酸產量，并產生少量氣體，從而促進腸道蠕動。體外發酵顯示，靈芝孢子粉低聚糖不僅能夠提高雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌的相對豐度，而且抑制大腸桿菌屬豐度。相關研究成果可為靈芝孢子粉多糖提取副產物的綜合利用及其低聚糖益生元的研究和產品開發提供依據。