基于蔗糖利用能力對豆乳發(fā)酵菌株的篩選及其應(yīng)用

趙羽，陸林，劉小鳴，崔樹茂，唐鑫，陳衛(wèi)，趙建新

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

大豆豆乳是一種營養(yǎng)豐富的植物蛋白飲品，含有豐富的大豆蛋白和游離氨基酸[1]，但是由于具有豆腥味，并且豆乳中的大豆低聚糖可被腸道菌群利用產(chǎn)氣進而引起腹脹[2-3]，所以豆乳飲品的接受度仍有待提高。

已有研究探討了如何利用乳酸菌對大豆豆乳中的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(包括蔗糖、棉子糖和水蘇糖)進行發(fā)酵，改善豆乳的不良風(fēng)味[4-5]。乳酸菌發(fā)酵大豆豆乳可生成乳酸、乙酸[6]等有機酸類物質(zhì)，以及醛酮類[7]揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，促使發(fā)酵豆乳產(chǎn)品形成細膩的凝乳質(zhì)地[8]，并賦予其特殊奶香味、果香味等發(fā)酵香味[9-10]，也可降低豆腥味的主要呈味物質(zhì)己醛的含量[11-12]。目前已有從保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌及發(fā)酵乳桿菌等常見酸奶發(fā)酵菌株中[13-15]篩選大豆豆乳發(fā)酵菌株的報道，SINGH等[16]測定了植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及瑞士乳桿菌在大豆豆乳發(fā)酵過程中蔗糖、棉子糖及水蘇糖的消耗情況，發(fā)現(xiàn)實驗菌株在豆乳發(fā)酵過程中優(yōu)先利用蔗糖。

本課題組對實驗室保藏的5株嗜熱鏈球菌和7株乳酸乳球菌的蔗糖利用差異性進行探究，并測定菌株在豆乳發(fā)酵過程中的生長、產(chǎn)酸及蔗糖的消耗情況，結(jié)合發(fā)酵終點豆乳樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測，為更有效地篩選豆乳發(fā)酵菌株并進行良好應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗試劑

胰蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸鈉、酵母浸粉、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、檸檬酸氫二銨、K2HPO4·3H2O、吐溫-80、瓊脂粉、NaCl、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、溴甲酚紫、果糖、蔗糖、棉子糖、半乳糖,均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。大豆,產(chǎn)地東北，市售。

1.1.2 實驗菌株

實驗所使用的5株嗜熱鏈球菌和7株乳酸乳球菌均由本實驗室提供。菌株信息如表1所示。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；ST3100型pH計，奧豪斯儀器(常州)有限公司；Thermo Trace 1310型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Thermo Fisher SCIENTIFIC；HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AW500SG型厭氧工作站，英國依萊泰科公司；5424 R型冷凍離心機，艾本德儀器有限公司；Waters1525液相色譜儀，美國Waters公司；MF-09多功能料理機，QG集團(英國)有限公司。

表1 實驗菌株信息Table 1 Information of strains used in this study

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

MRS培養(yǎng)基配方參照WU等[17]的配方，蔗糖-MRS等改良培養(yǎng)基(sucrose-MRS broth)在MRS培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，用蔗糖、棉子糖、果糖和半乳糖等量代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖。無糖-MRS培養(yǎng)基的配方在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上不添加葡萄糖。所有培養(yǎng)基在配制后需進行115 ℃高壓滅菌20 min后待用。

1.3.2 菌株糖利用能力測定

取1.0 mL活化后的菌液于1.5 mL離心管中6 000 r/min離心3 min，棄去上清液，再加入1.0 mL PBS緩沖液洗滌2次，制成菌懸液。吸取200 μL添加溴甲酚紫指示劑的蔗糖-MRS、棉子糖-MRS、果糖-MRS及半乳糖-MRS液體培養(yǎng)基加入96孔板中，吸取2 μL菌懸液加入培養(yǎng)基中，30或37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察孔板中培養(yǎng)基顏色變化情況(其中乳酸乳球菌在30 ℃下培養(yǎng)，嗜熱鏈球菌在37 ℃下培養(yǎng)，下文中皆分別采用此溫度進行培養(yǎng))。

1.3.3 菌株在蔗糖-MRS培養(yǎng)基中生長特性的測定

將活化3代后的菌液按照5×106CFU/mL添加量接種到蔗糖-MRS培養(yǎng)基中，分別置于培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，每隔3 h取樣，培養(yǎng)至15 h，測定樣品的活菌數(shù)、OD600值及產(chǎn)酸情況。其中，根據(jù)前期實驗確定菌株在MRS培養(yǎng)基中OD600值及活菌數(shù)的對應(yīng)關(guān)系，取活化3代后的菌液測定OD600值，根據(jù)目的接種濃度計算得出菌液所需添加量。

1.3.4 大豆豆乳的制備

稱取干大豆，每份100 g，分別加入1 L去離子水過夜浸泡。取浸泡后的大豆在沸水中熱燙2 min，加入600 mL去離子水，60 ℃研磨6 min后煮沸5 min，稍冷卻后用120目紗布過濾，并分裝至藍蓋瓶中，105 ℃滅菌10 min，冷卻至室溫后放入4 ℃冰箱保存待用。

1.3.5 菌株在大豆豆乳中生長特性的測定

將活化3代后的菌液按照5×106CFU/g添加量接種至大豆豆乳中，并置于30或37 ℃恒溫發(fā)酵培養(yǎng)，每隔3 h取樣，測定活菌數(shù)及產(chǎn)酸情況，直至豆乳凝乳(pH低于4.7)或發(fā)酵至15 h。每個取樣點留取適量樣品放置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.6 豆乳中蔗糖含量的測定

參考HATI等[18]的方法并進行部分改良。稱取2 g豆乳樣品，加入1.5 mL超純水稀釋后于60 ℃孵育10 min，依次加入0.25 mL 0.5 mol/L亞鐵氰化鉀溶液，0.25 mL 0.5 mol/L乙酸鋅溶液以及1.0 mL乙腈溶液，緩慢混合后在室溫下靜置4 h，以9 000 r/min轉(zhuǎn)速離心8 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，將過濾好的上清液在40 W功率下超聲5 min，排除溶解的氣泡，每個樣品設(shè)2個平行。利用HPLC對糖消耗情況進行分析，色譜柱為Waters NH2，4.6 mm×250 mm，流動相為V(乙腈)∶V(水)=70∶30，柱溫30 ℃，進樣體積20 μL，流速為1 mL/min。

1.3.7 發(fā)酵豆乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

參考LI等[19]的方法并通過預(yù)實驗改良。稱取5 g發(fā)酵豆乳樣品至20 mL萃取瓶中，依次加入1.0 g NaCl和2 μL 0.1 mg/mL的2-甲基-3-庚酮(內(nèi)標)。采用固相微萃取方法提取發(fā)酵豆乳中的風(fēng)味成分，萃取探頭是涂抹厚度為85 μm的 CAR/PDMS，在50 ℃條件下萃取30 min，解吸5 min，進行GC-MS分析。色譜條件：色譜柱WAX；升溫程序35 ℃保持3min，以6 ℃/min升至210 ℃，保持10 min；載氣流速(He)1.5 mL/min，進樣口溫度240 ℃，分流比為10∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV；離子源溫度240 ℃，質(zhì)譜范圍m/z33～350 amu。

1.3.8 統(tǒng)計分析及數(shù)據(jù)處理

本文中所有圖形均采用Origin Pro8軟件繪制；采用Xcalibur及TraceFinder軟件對豆乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行鑒定及定量(鑒定依據(jù)：在Fiehn.HP，MAINLIB，NISTDEMO及REPLIB質(zhì)譜庫中匹配因子>800，文庫命中數(shù)>3，確認峰>3)；采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)間的比較采用Duncan模型進行顯著性分析，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株對大豆豆乳碳水化合物利用能力的評價

實驗菌株對大豆豆乳中2種主要碳水化合物(蔗糖和棉子糖)及2種代謝產(chǎn)生的碳水化合物(果糖和半乳糖)利用實驗結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，嗜熱鏈球菌與乳酸乳球菌均不利用棉子糖，對其余3種碳水化合物利用能力具有顯著差異性。5株嗜熱鏈球菌均不利用果糖，而7株乳酸乳球菌果糖利用能力較好，反應(yīng)8 h內(nèi)溴甲酚紫完全變色。5株嗜熱鏈球菌中僅有15G-5、DYNDL7-5及DYNDL13-4三株菌株具有微弱半乳糖利用能力，24 h后溴甲酚紫微弱變色，7株乳酸乳球菌均可利用半乳糖，其中DYNDL21-2、DYNDL1-2、HeNa-28-3-GMM和DYNDL66M43四株菌株可快速利用半乳糖產(chǎn)酸，于8 h內(nèi)使溴甲酚紫完全變色。

表2 實驗菌株對大豆豆乳中碳水化合物的利用情況Table 2 The utilization of carbohydrate in soymilk byexperimental strains

注：“++”，生長8 h即變色，“+”，生長24 h變色，“+-”，生長24 h微變色，“-”，生長24 h不變色；溴甲酚紫變色范圍為5.2(黃色)～6.8(紫色)

實驗菌株在蔗糖的利用能力間具有顯著差異，除嗜熱鏈球菌DQHXN7M2外，其余4株嗜熱鏈球菌均可利用蔗糖，其中菌株A6蔗糖利用能力相對較差，于生長24 h后使溴甲酚紫變色。7株乳酸乳球菌實驗菌株均具有蔗糖利用能力，其中菌株DQHXN-NM38-14和DQHXNQ05M30蔗糖代謝較慢，其余5株實驗菌株均可在8 h內(nèi)使溴甲酚紫變色。

綜上所述，由于蔗糖為大豆豆乳中含量最高的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，且2種實驗菌株均具有良好蔗糖利用能力，因此根據(jù)上述實驗結(jié)果，選擇3株嗜熱鏈球菌(15G-5、DYNDL7-5和DQHXN7M2)及4株乳酸乳球菌(ZN8、DYNDL21-2、HeNa-28-3-GMM和DQHXNQ05M30)在蔗糖-MRS培養(yǎng)基中進行以蔗糖為單一碳源的生長、產(chǎn)酸測定。

2.2 菌株在蔗糖-MRS中的生長特性評價

實驗菌株在蔗糖-MRS中生長、產(chǎn)酸實驗結(jié)果分別如圖1和圖2所示，菌株在蔗糖-MRS中的生長、產(chǎn)酸能力具有顯著差異性，其中乳酸乳球菌蔗糖利用能力顯著優(yōu)于嗜熱鏈球菌。

圖1 菌株在蔗糖-MRS培養(yǎng)基中的生長情況Fig.1 Growth of different strains in sucrose-MRS broth

圖2 菌株在蔗糖-MRS培養(yǎng)基中的pH變化情況Fig.2 Changes pH of different strains in sucrose-MRS broth

4株乳酸乳球菌中，ZN8、DYNDL21-2和HeNa-28-3-GMM三株菌株在蔗糖-MRS培養(yǎng)基中生長良好(見圖1)，無明顯延滯期，3 h內(nèi)已進入對數(shù)生長期，6 h后進入穩(wěn)定期，同時OD600值可達到1.8左右；菌株DQHXNQ05M30蔗糖利用能力較差，僅在3h內(nèi)有微弱生長，OD600值僅達到0.579，且后期再無增長。菌株在蔗糖-MRS培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸情況(圖2)與生長結(jié)果相對應(yīng)，ZN8、DYNDL21-2和HeNa-28-3-GMM三菌株的pH值在接種3 h內(nèi)就已經(jīng)開始快速下降，并于6 h后趨于穩(wěn)定，最終穩(wěn)定期pH達到4.3以下。蔗糖利用能力較差菌株DQHXNQ05M30在生長期內(nèi)pH無明顯下降。

3株嗜熱鏈球菌中，15G-5和DYNDL7-5在蔗糖-MRS培養(yǎng)基的生長相較乳酸乳球菌較為緩慢，于生長3 h后進入對數(shù)生長期，12 h后進入穩(wěn)定期，OD600值分別為0.676與0.982。菌株在蔗糖-MRS培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸情況也與生長趨勢基本符合，3～9 h內(nèi)pH快速下降，于12 h后進入穩(wěn)定期pH值到達5.0以下。而菌株DQHXN7M2的蔗糖利用能力較差，生長與產(chǎn)酸數(shù)值隨時間均無顯著變化。

相較于嗜熱鏈球菌實驗菌株，乳酸乳球菌實驗菌株在以蔗糖為唯一碳源下生長延滯期更短，對數(shù)生長期內(nèi)的生長及產(chǎn)酸速率較快且終點pH較低，具有更強的蔗糖利用能力。根據(jù)菌株在蔗糖-MRS中的生長情況，分別選取3株乳酸乳球菌(DYNDL21-2、HeNa-28-3-GMM和DQHXNQ05M30)與2株嗜熱鏈球菌(15G-5和DQHXN7M2)進行大豆豆乳發(fā)酵實驗，進一步探究實驗菌株發(fā)酵大豆豆乳的能力。

2.3 菌株在大豆豆乳中的發(fā)酵情況評價

實驗菌株發(fā)酵豆乳凝乳情況如表3所示。乳酸乳球菌DYNDL21-2發(fā)酵6 h后凝乳，嗜熱鏈球菌15G-5及乳酸乳球菌HeNa-28-3-GMM發(fā)酵6 h后微凝，發(fā)酵9 h后凝乳。蔗糖利用能力較差菌株DQHXNQ05M30和DQHXN7M2發(fā)酵12 h后仍未凝乳。

表3 菌株在大豆豆乳中的凝乳情況Table 3 Curding time of different strains in soymilk

注：“-”表示未凝乳

菌株發(fā)酵大豆豆乳過程中的生長情況如圖3所示，不同菌株在大豆豆乳體系中生長情況差異顯著，具有較好蔗糖利用能力的菌株15G-5、DYNDL21-2及HeNa-28-3-GMM在大豆豆乳中表現(xiàn)出較強的生長能力，發(fā)酵終點活菌數(shù)較初始接種量均增長2個數(shù)量級左右。而2株蔗糖利用能力較差菌株DQHXNQ05M30和DQHXN7M2則較初始接種量僅分別增長1.38與0.62個數(shù)量級，顯著低于其他3株蔗糖利用能力良好的實驗菌株，推測是由于菌株不良的蔗糖利用能力限制其在大豆豆乳中的生長。

圖3 菌株在大豆豆乳中的生長變化情況Fig.3 Growth of different strains in soymilk注：不同字母標注菌株在大豆豆乳中的生長變化情況存在顯著性差異(P<0.05)

豆乳發(fā)酵過程中菌株產(chǎn)酸情況如圖4所示。實驗菌株在大豆豆乳中pH的變化趨勢與在蔗糖-MRS培養(yǎng)基中相似，相較于蔗糖-MRS培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸變化情況，嗜熱鏈球菌15G-5在大豆豆乳中發(fā)酵3 h內(nèi)的產(chǎn)酸速率較快，延滯期縮短，這可能是由于大豆豆乳中游離氨基酸含量較高，為嗜熱鏈球菌前期生長提供了更為適宜的營養(yǎng)環(huán)境，生長及產(chǎn)酸更為迅速。乳酸乳球菌DYNDL21-2在大豆豆乳中的產(chǎn)酸速率最快，于發(fā)酵6 h后到達發(fā)酵終點(pH<4.7)完成凝乳。其余1株乳酸乳球菌HeNa-28-3-GMM和1株嗜熱鏈球菌15G-5均在發(fā)酵9 h后達到發(fā)酵終點并完成凝乳，終點pH分別為4.55和4.59。2株蔗糖利用能力較差菌株在發(fā)酵12 h后仍未到達發(fā)酵終點，pH均在6.0以上。

圖4 菌株在大豆豆乳中的pH變化情況Fig.4 Changes pH of different strains in soymilk

根據(jù)不同實驗菌株在發(fā)酵大豆豆乳過程中體系內(nèi)蔗糖的消耗量(圖5)可以看出，乳酸乳球菌DYNDL21-2在發(fā)酵終點時(發(fā)酵6 h)消耗掉豆乳體系內(nèi)1.766 g/L蔗糖，占豆乳中蔗糖含量的65.38%(未發(fā)酵大豆豆乳中蔗糖含量為2.701 g/L)，顯著高于其余2株實驗菌株。在發(fā)酵9 h后，菌株HeNa-28-3-GMM和15G-5達到發(fā)酵終點，其蔗糖的消耗量分別達到1.650和1.740 g/L，均消耗掉體系內(nèi)60%以上的蔗糖。而2株蔗糖利用能力較差菌株則僅消耗掉大豆豆乳體系內(nèi)35%以下的蔗糖，顯著低于實驗菌株，與產(chǎn)酸情況一致，說明菌株的蔗糖利用能力對其在大豆豆乳中生長及產(chǎn)酸具有顯著影響。

圖5 菌株發(fā)酵大豆豆乳過程中蔗糖的消耗量Fig.5 Sucrose consumption in fermented soymilk by different strains注：不同字母表示不同菌株的蔗糖消耗量存在顯著性差異(P<0.05)

實驗中3株實驗菌株均可快速在大豆豆乳中產(chǎn)酸并實現(xiàn)凝乳，與前文中具有良好蔗糖代謝能力的菌株可快速發(fā)酵大豆豆乳凝乳的推測相一致，因此判斷蔗糖利用能力可作為評價大豆豆乳發(fā)酵菌株的重要指標。

2.4 發(fā)酵豆乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

利用GC-MS對3株實驗菌株發(fā)酵終點豆乳樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分析，其結(jié)果如圖6所示。根據(jù)相關(guān)研究可知[8]，大豆豆乳中不良風(fēng)味豆腥味的主要貢獻物質(zhì)為己醛，乳酸菌發(fā)酵可降低豆乳中豆腥味呈味物質(zhì)的含量。由圖6可以看出，未發(fā)酵豆乳中的己醛含量顯著高于發(fā)酵后的大豆豆乳，3株實驗菌株發(fā)酵終點豆乳樣品中的己醛含量均顯著下降，其中嗜熱鏈球菌15G-5的發(fā)酵終點豆乳樣品中己醛含量未檢出。除去降低大豆豆乳中原本存在的不良氣味貢獻物質(zhì)外，2，3-丁二酮、2，3-戊二酮以及乙偶姻等奶香味的主要貢獻物質(zhì)[20]經(jīng)發(fā)酵后均有不同程度的產(chǎn)生，其中HeNa-28-3-GMM菌株發(fā)酵大豆豆乳終點樣品中的2，3-丁二酮及乙偶姻的含量顯著高于其他菌株，分別達到了198.49和109.93 μg/L，使得發(fā)酵后的大豆豆乳具有令人愉悅的奶香味。

圖6 不同菌株發(fā)酵豆乳終點揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量Fig.6 Volatile flavor content at the end of fermented soymilk by different strains

此外，乳酸乳球菌DYNDL21-2和HeNa-28-3-GMM在發(fā)酵后還產(chǎn)生了較多的3-甲基丁醇，分別高達476.05和492.19 μg/L。醇類物質(zhì)是一種重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，在番茄、蘋果和甜瓜果實等天然食品中，是其主要的風(fēng)味物質(zhì)[21]。乳酸菌發(fā)酵過程中的亮氨酸代謝與3-甲基丁醇的生成相關(guān)，且該物質(zhì)在發(fā)酵乳中的含量與果香味呈正相關(guān)[22]。因此，3-甲基丁醇的生成對改善豆乳不良風(fēng)味具有重要作用。

綜合上述分析可知，實驗菌株發(fā)酵后的大豆豆乳在風(fēng)味方面得到了較大的改善與提高，主要通過菌株發(fā)酵降低大豆豆乳中不良風(fēng)味物質(zhì)的含量及生成優(yōu)良風(fēng)味物質(zhì)2種途徑。嗜熱鏈球菌15G-5通過發(fā)酵顯著降低大豆豆乳中豆腥味的呈味物質(zhì)己醛及2-戊基呋喃的含量，發(fā)酵終點樣品中該物質(zhì)未檢出，顯著低于未發(fā)酵豆乳。乳酸乳球菌HeNa-28-3-GMM通過發(fā)酵顯著提高大豆豆乳中2，3-丁二酮及乙偶姻的含量，發(fā)酵終點樣品具有奶香味特征。同時，2株乳酸乳球菌實驗菌株經(jīng)發(fā)酵均產(chǎn)生較多3-甲基丁醇，為發(fā)酵終點樣品賦予果香味特征。

3 結(jié)論

通過對5株嗜熱鏈球菌和7株乳酸乳球菌在大豆豆乳發(fā)酵過程中4種主要碳水化合物的利用能力進行測定，確定2種菌株均具有蔗糖代謝能力，具有發(fā)酵大豆豆乳的潛力。對初篩得到的7株菌株在蔗糖-MRS中進行生長測定，發(fā)現(xiàn)不同菌株之間蔗糖代謝能力存在顯著差異，其中乳酸乳球菌在蔗糖-MRS培養(yǎng)基中生長基本無延滯期，6 h后進入穩(wěn)定期，而嗜熱鏈球菌蔗糖代謝能力則相對滯后。選擇對蔗糖利用能力優(yōu)良的菌株進行大豆豆乳發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)蔗糖利用能力強的菌株可在大豆豆乳中快速生長并于6～9 h內(nèi)產(chǎn)酸凝乳，結(jié)合大豆豆乳發(fā)酵終點樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果，菌株發(fā)酵后豆乳中己醛含量顯著下降，并產(chǎn)生以2,3-丁二酮為代表的奶香味物質(zhì)和以3-甲基丁醇為代表的果香味物質(zhì)，為發(fā)酵后豆乳增加特殊發(fā)酵香味，可進一步改良大豆豆乳自身的不良風(fēng)味。

本文基于乳酸菌蔗糖利用能力對豆乳發(fā)酵菌株進行篩選，可高效獲得具有較好發(fā)酵特性的豆乳發(fā)酵菌株，并賦予發(fā)酵豆乳良好風(fēng)味，對發(fā)酵豆乳的生產(chǎn)與應(yīng)用具有一定價值。但如何進一步代謝大豆豆乳中低聚糖，緩解豆乳飲用后脹氣反應(yīng)，仍需進一步研究。