郫縣豆瓣中高產α-淀粉酶米曲霉篩選鑒定及產黃曲霉毒素特性評價

鄧維琴，肖晴芹，李雄波， 范智義，胡廷，陳功,2，張其圣,2，李恒,2,3*

1(四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都,611130) 2(四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山,620030) 3(成都市丹丹川菜調味品產業研究院有限公司，四川 成都,611730) 4(成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都,610106)

郫縣豆瓣是以紅辣椒、蠶豆為主要原料，食用鹽、小麥粉等為輔料，經過制曲、甜瓣子發酵、辣椒醅發酵及后發酵生香等階段釀制而成的傳統調味品[1]。郫縣豆瓣紅棕油亮、味辣香醇、醬香味濃郁，被譽為川菜之魂。郫縣豆瓣生產缺乏專用菌種，目前大部分豆瓣醬生產企業采用醬油曲精制曲發酵，然而醬油發酵為熟料發酵，豆瓣醬為生料發酵，兩者的發酵方式明顯不同，采用醬油發酵用的菌種發酵豆瓣醬存在著制曲效果不佳，發酵速度慢等問題。因此，篩選豆瓣醬發酵專用米曲霉，開發一種豆瓣醬專用的曲精對行業的發展具有重要意義。

α-淀粉酶在醬類食品發酵過程中發揮著重要的作用，它與糖化酶共同作用分解淀粉產葡萄糖，不僅為醬類食品后期發酵的酵母菌及其他微生物提供碳源，還是醇類、有機酸類風味物質形成的前體物質，且能與豆瓣醬中的氨基酸發生美拉德反應，產生令人愉悅的香氣成分[2-3]。董丹等[4]從郫縣豆瓣中篩選鑒定得到1株芽孢桿菌，所產淀粉酶活力可達80.24 U/mL。周紹琴[5]以貴州傳統豆瓣辣醬為研究對象，從中篩選出高酶活力菌株并探究該菌對產品后熟期的促熟性能，進而證明高酶活力菌株可縮短豆瓣發酵時間。因此，高產淀粉酶菌株的篩選及應用對提升豆瓣醬發酵速度，優化產品品質有重要意義。

米曲霉是目前豆瓣醬制曲中普遍應用的菌株，且產α-淀粉酶能力強。DEY等[6]優化米曲霉IFO-30103培養條件后產淀粉酶能力可達1 000 U/mg。SAHNOUN等[7]從一種甜醬中篩選出1株產淀粉酶的米曲霉，優化液態發酵條件后，培養液中α-淀粉酶酶活力可達1 220 U/mL[8]。然而關于郫縣豆瓣高產α-淀粉酶米曲霉的篩選及在豆瓣醬發酵中的應用還鮮見報道。本研究以傳統發酵郫縣豆瓣醬原料篩選高產α-淀粉酶米曲霉，對高效產酶菌株進行鑒定。由于黃曲霉和米曲霉基因相似度很高，因此2者極容易混淆，僅通過ITS(internal transcribed spacer)序列測定很難將二者區分[9]。黃曲霉菌株是代謝黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的重要污染微生物，在食品領域受到極大的重視。由于鑒定方法不完善，有的菌株即使被鑒定為米曲霉，仍有可能會代謝產生黃曲霉毒素[10]。因此，對米曲霉應用菌株進行多相鑒定，徹底區分黃曲霉和米曲霉，菌株產黃曲霉毒素能力的評價對高產淀粉酶菌株的推廣應用具有重要意義。本研究從傳統的豆瓣曲中篩選α-淀粉酶活力較高的菌株，通過ITS測序，構建系統發育樹分析，結合形態觀察，菌株產AFB1基因擴增及產AFB1可能性測定對菌株進行多項鑒定，評價其推廣應用的可行性。

1 材料和試劑

1.1 原料

以傳統制曲的豆瓣曲、傳統發酵的甜瓣子為菌株篩選原料。

1.2 培養基

PD培養基：馬鈴薯削皮，切塊，稱取200 g，添加500 mL蒸餾水，煮沸30 min，紗布過濾后取濾液；加入20 g葡萄糖，溶解后補加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

淀粉酶篩選培養基：可溶性淀粉10 g，蛋白胨2 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，K2HPO43 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

黃豆汁固體培養基：將除雜后的黃豆浸泡4 h以上，煮沸5 h。用紗布過濾后取黃豆汁1 L(調整濾液至5 Bé)，20 g可溶性淀粉，1 g KH2PO4，0.5 g MgSO4，0.5 g (NH4)2SO4，20 g瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

麩皮固體培養基：m(麩皮)∶m(黃豆粉)∶m(水)=4∶1∶4混合，浸潤30 min，拌勻。用1 L錐形瓶分裝，60 g/瓶，121 ℃滅菌20 min。

產毒培養基(AFPA)：蛋白胨 10 g，酵母粉 20 g，檸檬酸鐵 0.5 g，四氯醌 0.002 g，氯霉素15 g，瓊脂 15 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.3 主要試劑

可溶性淀粉、KI、I2，成都金山化學試劑有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4和甲醛(分析純)，成都市科隆化學品有限公司；H2SO4，四川西隴化工有限公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，TaqPCR Master Mix，生工生物工程股份有限公司；乳酸酚棉藍染液，北京索萊寶科技有限公司。黃曲霉毒素檢測試劑盒，深圳芬德生物技術有限公司。

1.4 儀器和設備

752G紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器股份有限公司；DYY-6D電泳儀,北京六一生物科技有限公司；BCD-201MLT冰箱,合肥美菱股份有限公司；H2050R-1離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司；PHSJ-4型pH計,上海儀電分析儀器股份有限公司；T960A智能梯度PCR儀,杭州晶格科學儀器有限公司； 霉菌培養箱,BMJ-250C、Multiskan FC型酶標儀,美國Thermo賽默飛世爾；LDZF-75KB型立體壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫療器械廠。

2 實驗方法

2.1 高產淀粉酶霉菌的篩選

2.1.1 初篩

取25 g樣品，梯度稀釋，涂布于孟加拉紅平板，28 ℃培養48 h；挑取菌株劃線于PDA培養基進行純化。將分離純化后的菌株點植于淀粉酶篩選平板，28 ℃培養72 h，噴灑稀碘液于菌落表面，觀察培養基透明圈。用游標卡尺測量菌落直徑和透明圈直徑，根據菌落直徑與透明圈直徑的比值初步篩選出產α-淀粉酶能力強的菌株，劃線于PDA斜面，28 ℃培養72 h，4 ℃保存。

2.1.2 復篩

將初篩得到產淀粉酶能力強的菌株接種于麩皮培養基，28 ℃培養16 h后，將其搖散繼續培養；24 h后進行第2次搖瓶，36 h時曲料結為較緊實的餅狀，此時應扣瓶培養至72 h，測定麩皮曲精中α-淀粉酶活力。

α-淀粉酶活力的測定參考徐歡歡[11]的測定方法。淀粉酶活力單位定義為：40 ℃，pH 6.0條件下5 min內水解1 mg淀粉的酶量，以U/g表示。

粗酶液制備：稱取麩皮曲精10 g，加入200 mL磷酸緩沖溶液(pH 6.0)，40 ℃水浴浸提1 h，間歇攪拌，過濾備用。

測定方法：移取5 mL可溶性淀粉溶液，在40 ℃水浴中預熱10 min，加入0.5 mL粗酶液，40 ℃水浴振蕩，準確反應5 min，加入5 mL 0.1 mol/L H2SO4終止反應；取0.5 mL反應液與5 mL碘液顯色，將反應液加入酶標儀的多孔板中測定OD620 nm值。以0.5 mL蒸餾水替代0.5 mL反應液為空白組，相同體積的緩沖液代替酶液反應為對照組。淀粉酶活力根據公式(1)計算：

(1)

式中：R0,對照組與碘液反應的吸光值；R,反應液與碘液反應的吸光值；D,粗酶液的稀釋倍數。

2.2 高產淀粉酶的霉菌鑒定

2.2.1 菌株形態學觀察

菌落形態：將所選菌株點殖于黃豆汁培養基，28 ℃培養72 h后觀察菌株形態。

顯微形態：挑取菌株的孢子及菌絲采用乳酸酚棉藍染液進行染色制片，采用250VX2雙目生物顯微鏡觀察菌絲、頂囊及孢子著陸形態。

2.2.2 分子生物學鑒定

將菌株接種于黃豆汁固體培養基中，28 ℃培養72 h。挑取菌絲，采用液氮研磨后，用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取霉菌DNA。以此DNA為模板，以ITS1、ITS4為引物擴增霉菌ITS片段，聚合酶鏈反應(polymerase chainreaction, PCR)體系為30 μL：ddH2O 12.5 μL、上下引物各1 μL、DNA模板3 μL、Mix酶12.5 μL。擴增反應條件為94 ℃預變性保持4 min；94 ℃變性1 min、60 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s，30次循環；72 ℃延伸10 min。擴增樣品送至北京擎科新業生物技術有限公司測序。測序得到的序列通過BLAST比對，采用Mega 5.0建立系統發育樹對菌株進行鑒定。

2.2.3 產毒培養基(AFPA)檢測方法

將菌株點植于AFPA固體培養基上，28 ℃ 培養2～3 d，觀察AFPA培養基上的特征并記錄。

2.2.4 產毒基因檢測方法

選取4個黃曲霉毒素合成的關鍵基因進行PCR擴增檢測，四者在黃曲霉毒素合成通路中都是必須的，包括調控aflO,aflP和aflQ,tub1[12]，擴增引物序列如表1所示。

表1 AFB1 關鍵基因擴增引物Table 1 Amplification primer AFB1 key gene

aflO、aflP和aflQ、tub1 PCR擴增條件：94 ℃ 預變性4 min； 94 ℃變性1 min， 60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min; 5個循環；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃延伸6 min。

2.2.5 菌株產黃曲霉毒素能力測定

接種4株菌株于PD液體培養基，28 ℃培養180 h，采用ELISA試劑盒測定發酵液中AFB1含量。具體檢測方法如下：

(1)取2 mL發酵液，加入2 mL蒸餾水，7 mL甲醇，振蕩5 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液進行分析。

(2)取出適量微孔板，加入50 μL標準品/樣本。

(3)加入AFB1酶標物50 μL /孔，同時加入抗體試劑50 μL /孔。

(4)蓋板膜蓋板后，至25 ℃避光環境中反應30 min。

(5)反應完成后將液體甩干，接著用洗滌液300 μL/孔充分洗滌4～5次。

(6)加入底物A液50 μL /孔，并加入底物B液50 μL /孔。

(7)蓋板膜蓋板后，至25 ℃避光環境中反應15 min。

(8)加入終止液50 μL /孔后用450的酶標儀測定每孔OD值。

2.3 數據分析

采用excel進行數據統計，實驗結果中的數據均為3個平行樣品均值，相對標準偏差在表和圖中分別以數值和誤差棒表示，采用origin 9.1作圖分析。采用SPASS進行鄧肯分析，置信區間為95%。

3 結果與分析

3.1 初篩

篩選得到70株霉菌，于淀粉酶篩選培養基培養，其中35株霉菌能在淀粉酶篩選平板產生透明圈，分別測量這35株菌的透明圈直徑d及菌落直徑D，計算比值，結果如表2所示。菌株30M-1的d/D值最大，達到3.128。其次為BM-2、BM-5、25M-1、14、DM2、16、19、DM1、18M-1、24，d/D值都大于2.000。

表2 菌株菌落直徑與透明圈直徑測定結果Table 2 Results of bacterial colony diameter and transparent circle diameter

3.2 α-淀粉酶活力測定結果

對上述35株霉菌于麩皮培養基培養，得到麩曲后測定其α-淀粉酶活力，測定結果如表3所示。供試菌株中，曲霉30M-1為產α-淀粉酶最高的菌株，所產淀粉酶活力高達3 496.915 U/g。此外，菌株DM1、16、DM2、19、14產淀粉酶活力也可達到2 000 U/g以上。篩選菌株淀粉酶活力強，遠高于目前已報道的菌株，選取產α-淀粉酶活力最強的30M-1、FN、DM2、16四株霉菌進行鑒定研究，為其推廣應用奠定基礎。

表3 α-淀粉酶活力測定結果Table 3 Results of alpha amylase activity determination

注：t檢驗P<0.05表示樣品間差異顯著，不同字母代表差異顯著

3.3 菌株鑒定結果

3.3.1 菌株形態學觀察結果

4株菌于28 ℃培養96 h后，菌株形態相似，如圖1所示。菌株16菌落呈黃綠色，質地呈絲絨狀，中央凸起；菌株30M-1呈現黃綠色，表面平坦；菌株DM2為黃綠色，顏色較深，中央凸起，表面具有放射狀褶皺；菌株FN為黃綠色，菌絲較短，疏松。

圖1 菌株形態特征Fig.1 Morphological characteristics of strains

顯微鏡形態觀察，如圖2所示，所選4株菌的孢梗莖壁薄且長，壁平滑，其分生孢子為圓形。頂囊呈球形，由頂囊的小梗產生孢子，分生孢子頭輻射狀，未發現菌核的形成。結合白飛榮等[15-16]對米曲霉的鑒定研究結果，初步判斷篩選出的4株菌均為米曲霉。

圖2 顯微產孢結構Fig.2 Microscopic characteristics of conidia

3.3.2 菌株分子學鑒定結果

測序結果提交NCBI進行BLAST序列同源性比對，采用MEGA 5.0利用鄰近法構建進化樹，其結果如圖3所示。4株菌株ITS序列相似度高，聚為一類；4株菌株均能與米曲霉，黃曲霉模式菌株聚為一類，說明和二者的相似度均較高。

圖3 試驗菌株系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of experimental strains

3.3.3 產毒培養基(AFPA)檢測結果

PITT等[17]研究發現，產毒的黃曲霉、寄生曲霉在AFPA培養基上，菌落反面呈明顯橙黃色，而不產毒的米曲霉AFPA培養基上菌落反面則呈黃褐色或淺黃色。將驗菌株三點接種于AFPA固體培養基上培養3 d后，菌株背面形態如圖4所示。

圖4 菌株AFPA培養特征Fig.4 Strain’s characteristic on AFPA

4株菌株于AFPA培養基培養3 d后菌落反面為黃褐色，說明菌株不產黃曲霉毒素。這與白飛榮等[15]研究米曲霉模式菌株在AFPA上培養的結果一致。

3.3.4 產AFB1關鍵基因

4種關鍵基因擴增結果如圖5所示。4株菌株均擴增出部分產AFB1的關鍵基因。菌株30M-1為模板未擴增出Aflp基因，而菌株16、FN、DM2擴增出了試驗的4種基因。黃曲霉毒素合成基因簇包含 25 個基因，長度大約 70 kb[18]。部分米曲霉菌株含有產毒基因，但基因發生突變、缺失或堿基替換，不能正常表達。黃曲霉菌株含有產毒基因，大部分正常表達，產黃曲霉毒素；部分菌株因產毒基因發生突變，不能正常表達產生黃曲霉毒素[16,19]。菌株是否產毒需要進一步進行產毒試驗驗證。

圖5 產AFB1關鍵基因擴增結果Fig.5 PCR amplicons of AFB1 genes

3.3.5 菌株培養液AFB1檢測結果

菌株DM2、FN、16、30 M-1發酵液中未檢出AFB1，因此沒有黃曲霉毒素污染風險。

本試驗中雖然試驗的大部分AFB1關鍵基因均在檢測的4株菌株DNA中擴增出，但菌株發酵液中AFB1檢測結果顯示，4株菌均不產AFB1，說明基因無法正常表達。

4 討論

米曲霉、醬油曲霉等有益霉菌由于高產淀粉酶、蛋白酶等特性被廣泛應用于醬油，大醬等產品的發酵[20]。淀粉酶分解淀粉類物質為小分子物質，對后期的發酵及風味形成具有重要意義。本文篩選的霉菌產淀粉酶能力強，其中菌株30M-1發酵麩皮曲中α-淀粉酶活力為3 496.915 U/g，FN、DM2、16發酵麩皮曲中α-淀粉酶活力分別為2 490.185、2 540.606和2 305.104 U/g。菌株于麩皮培養基中培養均生長良好，產生淀粉酶的能力高于目前報道的菌株。且菌株從傳統發酵的豆瓣曲及甜瓣子中篩選得到，適合于豆瓣醬發酵環境中生長，有應用于豆瓣醬發酵的潛力。

目前許多米曲霉(或者類似米曲霉的菌株)僅通過簡單的鑒定，未通過安全性評價就應用于食品的發酵。然而米曲霉和黃曲霉菌株在分類學上非常接近，僅通過簡單的ITS測序或者形態觀測很難將二者進行區分，二者極容易被混淆，所以在應用過程中很容易爆發黃曲霉毒素的污染，導致發酵食品中黃曲霉毒素檢出的情況[21-22]。因此，篩選發酵應用的菌株，對菌株進行徹底地鑒定及安全性評價是必須的。CHRISTENSE[23]提出，米曲霉是野生黃曲霉種的馴化種，CHANG等[19]認為米曲霉是黃曲霉的形態學變種，二者同屬于曲霉屬黃綠組，形態相近、基因組高度相似[24]，因此曲霉黃綠組菌株的鑒定需要結合基因測序，形態鑒定及產毒能力進行綜合分析。

本文篩選的4株高產淀粉酶的霉菌，通過菌落形態及顯微形態鑒定菌株為米曲霉；通過ITS測序構建系統發育樹結果顯示菌株和米曲霉和黃曲霉相似度高，均能聚為一類。綜合菌株產毒能力測定結果分析顯示，本文篩選的4株高產淀粉酶的菌株與米曲霉同源性近，不產AFB1。

5 結論

本研究篩選得到4株高產α-淀粉酶的霉菌，固態發酵麩皮培養基中α-淀粉酶活力均大于2 000 U/g，其中菌株30M-1固態發酵麩皮培養基中α-淀粉酶活達到3 496.915 U/g。4株菌在PDA培養基中菌落均為黃綠色，顯微結構與米曲霉結構相似，無菌核產生。AFPA產毒培養基中培養背面為橙黃色，無AFB1產生。ITS測序構建進化樹均聚為一類，與黃曲霉和米曲霉模式菌株相似度大于99%。4株菌均能擴增出部分產AFB1關鍵基因，但發酵液中未檢出AFB1，說明基因不能正常表達。多相鑒定結果顯示篩選的4株高產淀粉酶的霉菌與米曲霉更相似，沒有造成AFB1污染的風險，可以作為豆瓣醬發酵的備用菌株。