醬醪源腸球菌的特性研究與安全性評價

區錫敏，王阿利，孫張樂，魏梓晴，詹紫瑤，李影彤，戴月如，許嫚瑤， 黃桂東，鐘先鋒*

1(佛山科學技術學院 食品科學與工程學院，廣東 佛山，528231)2(廣東省傳統發酵食品工程技術研究中心，廣東 佛山，528231) 3(廣東省食品流通安全控制工程技術研究中心，廣東 佛山，528231) 4(佛山市釀造工程技術研究中心，廣東 佛山，528231) 5(佛山農業生物制造工程技術研究中心，廣東 佛山，528231)

腸球菌是乳酸菌常見菌屬之一，具有很強的生命力，能夠在比較寬廣的pH范圍、溫度、高/低滲透壓條件下生長[1-2]。腸球菌存在于大多數發酵食品中，對發酵食品的成熟以及風味形成具有重要作用，如發酵乳制品[3]、肉制品[4]等。有學者[5-7]從白酒窖池、泡菜腌漬水、豆豉和腐乳中分離鑒定出腸球菌，研究發現它們具有較好的抑菌、降膽固醇、抗氧化等益生特性，并經安全性評價判斷為安全。說明發酵食品來源的腸球菌類乳酸菌具有較好的益生特性而且相對安全，可作為發酵食品的潛在發酵劑。

近年的研究證實醬油中含有豐富的腸球菌資源[8-9]。SULAIMAN等[10]通過宏基因組測序技術對中國傳統醬油微生物組成變化及代謝功能進行了研究，發現魏斯氏菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬等乳酸菌在醬油釀造中具有重要作用。但有關參與醬油釀造的腸球菌資源開發程度不高，目前也無醬油相關腸球菌分離篩選及其特性和安全性的系統性研究。

本實驗室前期從醬醪中分離鑒定出3株腸球菌，且表現出較好的綜合特性。為了更好地開發利用這些菌株，保證其使用的安全性，通過生長曲線、產酸、抑菌活性實驗，探究該菌株的功能特性，通過毒力基因檢測、氨基酸脫羧酶試驗、吲哚試驗、溶血試驗和耐藥性檢測，了解該菌株是否具有安全性，以充分挖掘醬油釀造中腸球菌資源，為醬油中腸球菌資源開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

試驗菌株：分離自醬醪的3株腸球菌，分別命名為E1、E2、E3。

MRS改良培養基、細菌基因組DNA提取試劑盒、靛基質試劑盒、氨基酸脫羧酶對照管、精氨酸脫羧酶生化管、賴氨酸脫羧酶生化管、鳥氨酸脫羧酶生化管、哥倫比亞血瓊脂培養基，廣東環凱微生物科技有限公司；腸球菌屬毒力基因PCR引物，上海美吉生物醫藥科技有限公司；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司；糞腸球菌(EnterococcusfaecalisCICC 10396)，中國工業微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)，上海魯傲科技有限公司；金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)，南京茂捷微生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

EPOCH-2酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；LRH-150恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；GR60DA全自動滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司； FE-28 pH計、ME104電子分析天平，梅特勒-托利多精密儀器公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SY-1220恒溫水浴鍋，美國精騏有限公司；ALLEGRA-64R臺式高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；FlexCycler2 PCR儀，德國耶拿分析儀器股份公司；DYY-7C凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 特性研究

1.2.1.1 腸球菌生長曲線的測定

根據文獻[11]，進行適當修改，將已鑒定的腸球菌菌株活化3代，調節OD600nm=0.6，以體積分數2%接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養0～24 h，每隔2 h使用酶標儀測定菌株OD600nm值。以OD600nm值為縱坐標，時間間隔為橫坐標繪制不同菌株的生長曲線。

1.2.1.2 腸球菌產酸能力的測定

根據文獻[12]，適當修改如下：將已鑒定的腸球菌菌株活化3代，調節OD600nm=0.6，以體積分數2%接種量接種于含60 g/L NaCl的MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h。以10 000 r/min離心5 min,收集上清液，使用pH計測定不同菌株的培養液pH值。

1.2.1.3 腸球菌抑菌能力的測定

根據文獻[13]，進行適當修改，使用雙層瓊脂擴散法。首先在滅菌平板中加入10 mL含有20 g/L水瓊脂培養基，待水瓊脂凝固后放入滅菌牛津杯，接著將20 mL LB瓊脂培養基倒入水瓊脂培養基上，隔夜凝固后使用指示菌涂布，用無菌鑷子將牛津杯取出，在孔內加入180 μL試驗菌株菌液，室溫擴散4 h后在37 ℃條件下培養10～12 h。測量透明抑菌圈的直徑，讀數精準到0.01 mm。指示菌為大腸桿菌(ATCC 25922)與金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)。

1.2.2 安全性驗證

1.2.2.1 毒力基因PCR檢測

根據文獻[14]，進行適當修改，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取試驗菌株的DNA，采用PCR擴增技術對腸球菌屬常見的6種毒力基因進行檢測，以證明腸球菌的安全性[14]。已明確的6種毒力基因的引物序列信息見表1，以糞腸球菌(CICC 10396)為陽性對照。

表1 毒力基因的引物序列信息Table 1 The primer sequences of virulence genes

反應體系：總反應體系為50 μL，3 μL對照樣，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，5 μL 10× EasyTaqBuffer，4 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.5 μL EasyTaqDNA聚合物，35.5 μL ddH2O。

擴增條件：預變性，95 ℃ 4 min；32個循環(變性：94 ℃ 30 s；退火：56/52 ℃ 1 min；延伸：72 ℃ 1 min)；再延伸，72 ℃ 7 min；除efaA基因退火溫度為52 ℃外，其余基因退火溫度為56 ℃。

1.2.2.2 氨基酸脫羧酶試驗

根據文獻[7]并進行適當修改如下，將試驗菌株接種于精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶生化管中，并同時接種于氨基酸脫羧酶對照管中，用液體石蠟封口，于37 ℃培養24 h。賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶試驗管與對照管均變黃為陰性，試驗管變黃綠色且對照管變黃為陽性；精氨酸脫羧酶試驗管與對照管均變黃為陰性，試驗管變藍綠色且對照管變黃為陽性。大腸桿菌(ATCC 25922)為陽性對照菌株。

1.2.2.3 吲哚試驗

根據文獻[15]進行適當修改，試驗菌株接種于蛋白胨水培養基中，37 ℃恒溫培養48～72 h，向培養基中滴加5～8滴靛基質試劑，并輕搖試管觀察顏色變化。若液面出現紅色則為陽性結果，否則為陰性結果。大腸桿菌(ATCC 25922)為陽性對照菌株。未接種的蛋白胨水培養基為空白對照。

1.2.2.4 溶血試驗

根據文獻[15]進行適當修改，試驗菌株劃線接種于哥倫比亞血平板中，37 ℃培養24 h，觀察菌落周圍變化情況。若菌落周圍形成透明圈則為β-溶血；若出現綠色圈，則為α-溶血；若無溶血環，則為無溶血。以金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)為陽性參照菌株。

1.2.2.5 耐藥性檢測

根據文獻[7]進行適當修改，使用藥敏紙片擴散法進行藥敏試驗。使用的藥敏紙片種類為青霉素、氨芐西林、四環素、紅霉素、諾氟沙星和萬古霉素等抗生素，共計6種。將活化好的試驗菌株濃度調節至1.5×108菌數/mL(0.5個麥氏濃度)，涂布接種于MRS培養基中，靜置5 min后將相應藥敏紙片貼在培養基上。于37 ℃培養箱中培養24 h，用游標卡尺精確測量并記錄每個藥敏紙片抑菌圈直徑。以金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)為對照菌株。

1.3 數據處理

數據統計與處理采用Excel 2013以及SPSS 17.0，繪圖采用Origin 9.0。

2 結果與分析

2.1 特性研究

2.1.1 腸球菌生長曲線繪制

生長曲線的測定有助于了解菌株的生長及代謝情況，由圖1可知，腸球菌在0～2 h期間，生長緩慢；2～8 h進入對數生長期；接種12 h后，生長速率減緩，進入了生長穩定期。其中腸球菌E1與E2的生長趨勢總體相似，但腸球菌E3在接種6 h后OD600nm值高于另外2株，表明腸球菌E3的生長能力比腸球菌E1和E2強。本研究3株腸球菌的生長趨勢與翟夢凱的研究結果一致[14]。

圖1 腸球菌生長曲線Fig.1 Growth curves of Enterococcus

2.1.2 腸球菌產酸能力分析

測定培養基體系pH有助于了解腸球菌的產酸能力。由圖2可知，腸球菌在含鹽MRS培養基上生長24 h后，培養液的pH在4.5左右，腸球菌E1與E2之間沒有顯著差異(P>0.05)，但腸球菌E3略高于其他2株菌。結果表明，3株腸球菌具有較好的產酸能力；腸球菌E1與E2的產酸能力相近，且稍強于腸球菌E3。楊行等[16]對分離自傳統發酵酸奶的30株腸球菌產酸能力進行了測定，結果表明，腸球菌產酸體系pH在4.0～5.8之間；王冉等[17]從四川冬菜及發酵液中分離到若干腸球菌，研究表明腸球菌產酸體系pH在培養24 h時大多為4.4左右。與其他來源的腸球菌相比，醬醪源腸球菌同樣具有較好的產酸能力。

圖2 腸球菌的產酸能力Fig.2 Acid production capacity of Enterococcus

2.1.3 腸球菌抑菌能力分析

以大腸桿菌(ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)作為指示菌測定了腸球菌的抑菌活性。試驗菌株對大腸桿菌無明顯抑制作用，但能抑制金黃色葡萄球菌的生長，抑菌圈直徑在9.50～10.00 mm(圖3)，3株菌的抑菌能力無顯著差異(P>0.05)。鄭偉[18]從健康動物糞便中分離的腸球菌對金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用；周佳[19]從高原奶渣中分離的腸球菌發酵上清液對金黃色葡萄球菌有微弱抑制作用；而翟夢凱[14]所報道的由雞膽汁中分離的腸球菌對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為13 mm，說明不同來源的腸球菌在抑菌能力上會有差異，醬醪源腸球菌抑菌能力有一定的優勢。

圖3 腸球菌的抑菌能力Fig.3 Antibacterial activity of Enterococcus

2.2 安全性驗證

2.2.1 相關毒力基因分析

腸球菌屬的致病性與毒力基因密切相關[13]。采用PCR檢測試驗菌株的毒力基因，糞腸球菌(CICC 10396)作為陽性對照菌株，毒力基因檢測結果如圖4所示。3株試驗菌株中沒有檢出腸球菌屬常見的6種毒力基因(asa1、cylA、efaA、esp、gelE、hyl)；而陽性對照菌株糞腸球菌檢出了3種毒力基因efaA(705 bp)、esp(510 bp)、gelE(213 bp)。腸球菌屬的毒力基因具有較多種類，以上6種毒力基因分別為聚合物質、溶血素、黏附素、表面蛋白、產胞外酶、透明質酸酶類毒力基因，各菌株含有的毒力基因之間會有一定差異[20]。以上結果表明試驗菌株不含有這6種腸球菌屬常見的毒力基因，相對安全。該結果與翟夢凱[14]研究結果基本一致。

1～6、7～12、13～18、19～24號泳道分別為腸球菌E1、E2、E3、糞腸球菌的asa1、cylA、efaA、esp、gelE、hyl基因PCR產物；M-Marker圖4 毒力基因檢測結果Fig.4 Test results of virulence genes from Enterococcus

2.2.2 生物胺與吲哚生成分析

通過氨基酸脫羧酶試驗可以檢測菌株分解氨基酸生成生物胺的能力。精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸經氨基酸脫羧酶作用后分別形成精胺、尸胺和腐胺。過多生物胺類物質積累可引起嘔吐、惡心、發燒等食物中毒的癥狀[21]。吲哚試驗可檢測試驗菌株是否代謝產生色氨酸酶分解色氨酸生成吲哚[15]。色氨酸為人體必需氨基酸，其代謝失調時，會影響免疫及消化功能、引起神經系統功能障礙等[22]。

生物胺與吲哚生成結果如表2所示，陽性對照菌株大腸桿菌的精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶試驗以及吲哚試驗都呈陽性，而腸球菌E1、E2、E3除精氨酸脫羧酶呈陽性外其他試驗結果都呈陰性。菌株精氨酸脫羧酶結果為陽性，表明腸球菌可將精氨酸經精氨酸脫羧酶作用生成精胺。精胺為常見的生物胺，在生物體細胞中起到重要的作用[23]，精胺沒有明確危害健康的作用，但與氮結合會產生亞硝酸鹽，也會加強組胺與酪胺的毒性[24]。據報道，食物中存在少量生物胺類物質對人體無明顯影響[25]。谷靜思[26]發現腸球菌產生物胺總量在20～40 mg/kg左右，考慮到實際生產中的應用，該含量遠低于食品中生物胺總量建議攝入量1 000 mg/kg以下[27]。說明本研究腸球菌是相對安全的。

表2 生物胺與吲哚生成結果Table 2 Test results of bioamine and indole production ofEnterococcus

注：“+”表示反應呈陽性；“-”表示反應呈陰性

2.2.3 溶血作用分析

細菌的溶血作用在感染過程中起到重要致病作用[28]，本研究溶血試驗結果如圖5所示。

a-金黃色葡萄球菌;b-腸球菌E1;c-腸球菌E2;d-腸球菌E3圖5 溶血試驗結果Fig.5 Hemolysis test result of Enterococcus

經哥倫比亞血瓊脂培養基37 ℃培養24 h后，陽性對照金黃色葡萄球菌菌落周圍顯示出透明圈，表現出β-溶血。腸球菌E1、E2、E3菌落周圍既無透明圈也無綠色圈，屬于沒有毒性的γ-溶血，即不會產生溶血作用。結果表明，腸球菌E1、E2、E3在溶血作用方面是安全的，這與王夢姣等[29]的腸球菌溶血試驗結果一致。

2.2.4 耐藥性分析

抗生素耐藥性檢測是乳酸菌安全性評價較重要的內容，雖然有少部分學者認為乳酸菌具有一定的耐藥性是有利的，因為當人類使用抗生素治療疾病時不會把人體內的益生菌一同殺滅；但當乳酸菌具有潛在致病性，一旦成為致病原時，它們所具有的耐藥性會給治療帶來麻煩[21]，因此有必要對試驗菌株進行耐藥性分析。

試驗菌株耐藥性試驗的抑菌圈直徑見表3，參考表4中的解釋標準進行結果判斷。

由表3可知，金黃色葡萄球菌對6種抗生素敏感；腸球菌E1、E2對3種抗生素敏感(四環素、諾氟沙星、萬古霉素)，對3種抗生素耐藥(青霉素、氨芐西林、紅霉素)；腸球菌E3對3種抗生素敏感(四環素、紅霉素、萬古霉素)，2種抗生素耐藥(青霉素、氨芐西林)，1種抗生素中等耐藥(諾氟沙星)。對不同菌株同一種抗生素耐藥性進行方差分析發現，金黃色葡萄球菌與3株腸球菌對6種抗生素的耐藥性有顯著差異(P<0.05)，3株腸球菌對青霉素、紅霉素、諾氟沙星的耐藥性呈顯著差異(P<0.05)，對其余3種抗生素的耐藥性無顯著差異(P>0.05)。

表3 菌株耐藥性試驗的抑菌圈直徑及試驗結果

注：括號內字母為耐藥性判斷結果，S為敏感，I為中介，R為耐藥；其中藥敏紙片直徑為6.35 mm

表4 抑菌圈直徑解釋標準Table 4 Interpretive criteria of antibacterial circlediameter on Enterococcus

3 結論

本研究對分離自醬醪的3株腸球菌進行了特性研究以及安全性驗證。相關結果表明：3株腸球菌具有較強的生長力，產酸能力較好且對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。菌株安全性驗證中未檢出相關毒力基因，氨基酸脫羧酶試驗與吲哚試驗除精氨酸脫羧酶為陽性外其余酶均為陰性，無溶血作用，對多種抗生素敏感；系列安全性驗證表明這3株腸球菌是相對安全的。后續將對其在醬油發酵的實際生產中發揮提升作用進行更深入研究，為開發醬油中腸球菌資源提供科學理論基礎，為醬油釀造提供微生物資源。