茶多酚熱超聲聯合處理對冬瓜沙門氏菌數量的影響及其自適應神經網絡生長模型的構建

苗英杰，呼高偉，付永前

(臺州學院 生命科學學院，浙江 臺州，318000)

冬瓜(Benincasahispida，(Thunb.) cogn.)是我國熱帶和亞熱帶地區普遍種植的蔬菜作物。近年來，鮮切加工和包裝的冬瓜片越來越受到人們的歡迎。鮮切蔬菜指經過清洗、修整、分切、保鮮和包裝等步驟，可以直接用于鮮食或烹飪，而沒有經過熱加工的蔬菜制品。鮮切蔬菜具有方便、衛生等特點，但其工藝可能帶來更大的微生物污染風險[1]。同時，由于鮮切蔬菜對于品質的要求較高，傳統的高溫殺菌技術對于鮮切蔬菜并不完全適用[2]。因此，開發新型保鮮方法，有效延長鮮切冬瓜的保質期，建立可靠的鮮切冬瓜微生物數量預測模型，降低食源致病微生物帶來的食品安全風險勢在必行。

超聲波處理會在液體中產生交替的低壓和高壓波，造成劇烈的氣泡形成和潰滅，強烈的剪切力、瞬時高壓和高溫可以擊穿微生物的細胞壁和細胞膜，將超聲波處理與致死溫度或亞致死溫度結合使用，就是所謂的熱超聲技術(thermosonication, TS)。與傳統的熱處理方法相比，它使用的溫度更低，處理時間更短，能保持更好的產品風味、質地和外觀[3-4]。當與化學或生物殺菌劑一起使用時，熱超聲處理可以提高殺菌劑穿透細胞膜的效率，從而提高殺菌劑的殺菌效率[5-6]。茶多酚(tea polyphenols, TP)是從茶葉中提取的多酚物質，具有抗氧化、抗癌、抗病毒、抗菌等多種生理功能[7-8]。作為一種食品添加劑，茶多酚已經被廣泛應用于多種食品的保鮮和加工[9-11]，表現出較好的效果。茶多酚結合熱超聲處理，有望在較低的溫度和較短的時間下取得較好的殺菌效果，同時減少殺菌劑的使用劑量，保持更好的產品品質。

自適應神經模糊推理系統(adaptive neuro-fuzzy inference system，ANFIS)是一種融合人工神經網絡(artificial neural networks，ANN)和模糊推理系統(fuzzy inference systems，FIS)優點的協同混合系統。它采用混合學習方法，從輸入輸出數據對中生成一組具有適當隸屬函數(membership function, MF)的模糊因果(if-then)規則。ANFIS具有訓練速度快、收斂速度快、學習效果好等優點，已被用作農業和食品技術中的建模和預測工具[12-13]。

沙門氏菌是公共衛生學上具有重要意義的食源性致病菌，據統計在世界各國的細菌性食物中毒事件中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，中國內陸地區細菌性食物中毒也常以沙門氏菌為首位，國家標準要求多數食品中不得檢出沙門氏菌。本研究的目的是探索茶多酚聯合熱超聲處理對鮮切冬瓜貯藏過程中沙門氏菌菌落數量的影響，研究冬瓜在不同儲藏溫度下沙門氏菌數量變化的規律，并建立和評估具有不同隸屬函數的ANFIS菌落數量預測模型。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和菌株

新鮮冬瓜購自本地的農貿市場;茶多酚購自國藥集團化學試劑有限公司;胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB)、緩沖蛋白胨水(BPW)和木糖賴氨酸Tergitol 4瓊脂(xylose-lysine-tergitol 4，XLT4)購自北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司;其他試劑均為國產分析純;沙門氏菌菌株ATCC 9270(腸沙門氏菌腸亞種 鴨血清型，Salmonellaentericasubsp.entericaserovarAnatum)、ATCC 13076(腸沙門氏菌腸亞種腸炎血清型，Salmonellaentericasubsp.entericaserovarEnteritidis)和ATCC 14028(腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清型，Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphimurium)為標準菌株，保藏于本實驗室。

1.2 儀器與設備

生物安全柜(BSC-04IIB2)，蘇凈安泰；恒溫培養箱(BPMJ-70F)，上海一恒；小型高速離心機(HICO21)，上海生工；超低溫冰箱(Forma 905)，賽默飛世爾；臺式超聲破碎儀，力辰科技；無菌拍打式均質機(HX-4)，上海滬析。

1.3 菌株及生長條件

將3株沙門氏菌菌株ATCC 9270、ATCC 13076和ATCC 14028分別在37 ℃的TSB培養基中培養至指數期，離心分離。將細菌細胞重新懸浮于BPW中，然后將3株沙門氏菌等量均勻混合，形成沙門氏菌混合液。用BPW連續10倍稀釋菌體混合液，取0.1 mL不同濃度菌體稀釋液涂抹在XLT4瓊脂平板，并在37 ℃下孵育，以計數沙門氏菌菌落，制成最終細胞濃度約為9.0 lg CFU/mL的沙門氏菌菌液。

1.4 冬瓜樣品制備和接種

冬瓜清洗后使用無菌刀板切成10 g左右同等尺寸的小塊，放在無菌生物安全柜中晾10 min。隨后，用無菌微量吸管將50 μL新鮮沙門氏菌混合液均勻接種于冬瓜樣品表面，在生物安全柜內干燥30 min，以確保細菌充分吸附到樣品表面。然后將樣品翻轉，在樣品的另一側重復相同的操作。經上述操作接種后，沙門氏菌的初始水平大約為7.0 lg CFU/g。對照組樣品采用了與上述類似的程序進行處理，僅稀釋倍數有差異，其初始沙門氏菌水平為4.6 lg CFU/g(與熱超聲茶多酚聯合處理后的處理組樣品菌落數量相等)。沙門氏菌的準確濃度經連續梯度稀釋后，采用XLT4平板計數確認，計數方法參見1.6沙門氏菌計數。

1.5 樣品處理和儲藏

使用臺式超聲波破碎儀進行熱超聲處理。將接種的樣品與去離子水按樣品∶水=1∶3(w/v)的比例放置在無菌的超聲波破碎儀中，400 W功率下，50 ℃處理1 min。立即將冬瓜樣品從去離子水中取出，在20 ℃的質量濃度為10 g/L的茶多酚溶液中浸泡5 min，樣品與茶多酚溶液的比例為1∶3(g∶mL)，隨后樣品放置在生物安全柜中約10 min以除去過量的液體。處理后，立即將樣品置于無菌均質袋內，密封保存在(4±1)、(10±1)和(25±1) ℃的溫度下，初始沙門氏菌水平約為4.6 lg CFU/g的對照樣品未經處理，保存在相同的條件下，定期取樣計數沙門氏菌。

1.6 沙門氏菌計數

在每個含有10 g樣品的均質袋中加入90 mL BPW，密封后放入無菌均質機中，持續60 s均質2次。將均質機產生的勻漿在BPW中連續梯度稀釋，并取每個梯度的稀釋液0.1 mL涂布到XLT4瓊脂上，在37 ℃下培養24 h，以計數菌落。XLT4瓊脂是針對沙門氏菌的選擇性培養基，其在XLT4上顯示特異性的顏色和菌落特征，通常為黑色或黑色為中心的菌落，便于鑒別和計數。

1.7 基于ANFIS的沙門氏菌生長模型的構建及數據分析

ANFIS系統基于模糊推理系統的神經網絡來生成和優化決策規則。如圖1所示，在ANFIS體系結構的5層中，第1層是模糊化層，該層中的節點是具有隸屬函數的自適應節點，其參數稱為前件參數。第4層是去模糊層，該層中的節點是具有隸屬函數的自適應節點。其參數稱為后件參數。第2、3和5層分別是規則層、規范化層和輸出層，其節點是固定節點。本文采用最小二乘法(least-squares algorithms，LS)和反向傳播法(back-propagation algorithms，BP)相結合的混合訓練方法，嘗試選擇8種不同的隸屬函數類型，對ANFIS模型的前件參數和后件參數進行優化。

模型構建通過Matlab 2016a的ANFIS工具箱進行。將處理組實驗數據輸入軟件，每個輸入/輸出數據對包含2個輸入值(存儲溫度和存儲天數)和1個輸出值(沙門氏菌菌落數量)。實驗數據對被隨機分入訓練集(60%)，驗證集(18%)和預測集(22%)。利用預測值與實驗值線性回歸曲線的確定系數(R2)和均方根誤差(RMSE)估計ANFIS模型的預測性能。用SPSS v17.0統計軟件對預測值與實驗值進行線性回歸分析。

a-自適應神經模糊推理系統的結構和算法；b-本研究中ANFIS模型的構成圖1 自適應神經模糊推理系統結構Fig.1 Adaptive neuro-fuzzy interface system architecture

2 結果和分析

2.1 儲藏期間沙門氏菌數量

茶多酚是從茶葉中提取的多酚類物質，具有廣譜的抗菌性，茶多酚能夠抑制細菌生物膜的形成，降低對宿主的吸附能力，中和細菌毒素，降低細菌對宿主的致病性[7]。沙門氏菌是最為多發的食源性致病菌之一，本研究以沙門氏菌為例，研究熱超聲和茶多酚聯合處理對鮮切冬瓜中致病菌數量的影響。由于冬瓜內部通常是無菌的，實驗中測得的沙門氏菌均來自于人工接種。接種的鮮切冬瓜片經熱超聲和茶多酚聯合處理后，在25、10和4 ℃下貯藏。用平板計數法監測沙門氏菌菌落數量，結果如圖2所示。

a-4 ℃；b-10 ℃；c-25 ℃圖2 鮮切冬瓜在不同溫度下貯藏時沙門氏菌菌落數量Fig.2 Salmonella populations in fresh-cut wax gourd during storage at different temperatures

處理前沙門氏菌菌落數量約為(6.80±0.04)lg CFU/g，處理后約為(4.58±0.08)lg CFU/g，即熱超聲和茶多酚聯合處理可以有效地將鮮切冬瓜中沙門氏菌的數量減少約2.20 lg CFU/g (P<0.05)。儲藏過程中，處理組的樣本沙門氏菌數量絕大多數情況下均顯著低于相應的對照組(P<0.05)。在4 ℃下(圖2-a)，兩組樣品菌落數量均呈現先下降后平穩的趨勢；處理組在最初的7 d內迅速下降，在隨后幾天內圍繞在2.50 lg CFU/g上下波動；對照組在前8 d內顯著下降，在隨后的幾天內圍繞在3.50 lg CFU/g上下波動。在10 ℃下(圖2-b)，處理組菌落數量在第1天內顯著減少約0.40 lg CFU/g(P<0.05)，在第2～5天內緩慢下降，然后在剩余的幾天內圍繞4.0 lg CFU/g上下波動；對照組菌落數量呈現非常緩慢的增長趨勢。在25 ℃下(圖2-c)，兩組樣品菌落數量均呈現先上升后下降的趨勢；對照組樣品各階段到來時間較早。

在不同的水果和蔬菜中，沙門氏菌數量在儲藏過程的規律有差異。STRAWN等[14]報道了芒果和番木瓜中沙門氏菌的數量變化情況；火龍果中的情況與番木瓜相似[15]；SANT'ANA等[16]報道了9種即食蔬菜中沙門氏菌的生長情況；FENG等[17]報道了7種鮮切水果中沙門氏菌的生長情況；本研究首次報道了鮮切冬瓜中沙門氏菌生長情況。冬瓜和其他大多數水果蔬菜在4 ℃下儲藏時，沙門氏菌菌落數量保持不變或下降，在10～15 ℃下菌落數量顯著大于4 ℃，并且根據水果和蔬菜種類的不同，呈現上升或下降等不同的趨勢。在25 ℃下，菌落數量顯著高于4 ℃和10～15 ℃，并且絕大多數呈現明顯的增長趨勢。因此，儲藏溫度對于沙門氏菌的生長具有非常巨大的影響，低溫是抑制鮮切果蔬沙門氏菌生長、保證食品安全的重要保障。10～15 ℃下沙門氏菌呈現的不同生長趨勢，可能與水果和蔬菜本身的性質有關，例如果蔬的pH、含水量、含糖量、質地、是否含有抗菌物質等。

熱超聲的殺菌效果好于單獨使用超聲波和較高的溫度；茶多酚是一種來源于茶葉的非揮發性天然提取物，安全性好，可以留存在儲藏的全過程中，起到持續的抑菌作用。本研究中，處理組的樣本沙門氏菌數量在不同儲藏條件下均顯著低于相應的對照組(P<0.05)。特別是在10 ℃貯藏時，對照樣品中沙門氏菌菌落數量仍呈現緩慢的增長趨勢，而處理組樣品中沙門氏菌菌落數量已呈現明顯的下降趨勢。可見，熱超聲和茶多酚聯合處理能夠顯著減少鮮切冬瓜中沙門氏菌的數量，并且在儲藏過程中持續抑制冬瓜保鮮過程中沙門氏菌的生長，保持較好的蔬菜品質，是一種具有較大應用潛力的蔬菜保鮮技術。

2.2 基于ANFIS的沙門氏菌生長模型的構建

采用ANFIS系統對鮮切冬瓜中沙門氏菌生長數據進行擬合和預測。經過優化，模型的每個輸入變量采用2個隸屬函數，生成8個因果規則，并測試了8種不同類型的隸屬函數的建模效果。模型在訓練和預測階段的預測數值和處理組實驗數據之間的相關性如圖3所示，模型訓練和預測階段的RMSE和R2如表1所示，各模型的輸出值的分布曲面如圖4所示。

圖3中，采用不同隸屬函數構建的ANFIS模型，訓練和預測階段的各數據點呈現集中的線性分布，數據點與其回歸直線距離較近，訓練和預測階段的回歸直線高度重合，這表明ANFIS模型在訓練和預測階段的穩定性和一致性較好。

由表1可見，采用不同隸屬函數構建的模型，其RMSE均小于0.2，R2>0.98，表明ANFIS系統能較好地預測不同貯藏溫度下鮮切冬瓜沙門氏菌的數量。根據RMSE越小越好、R2越大越好的原則可見，在訓練階段dsigmf和psigmf函數的性能最好，而在預測階段，gaussmf函數的性能最好。

(a)trimf，(b)trapmf，(c)gbellmf，(d)gaussmf，(e)gauss2mf，(f)pimf，(g)dsigmf和(h)psigmf(下同) 圖3 熱超聲和茶多酚處理的鮮切冬瓜在貯藏過程中，沙門氏菌數量實驗值與采用不同隸屬函數得到的ANFIS模型預測值的相關性Fig.3 Correlation between experimental and predictedSalmonella population in fresh-cut wax guard treated by thermosonication and tea polyphenol during storage using the ANFIS models注：ANFIS模型在預測階段(○)和訓練階段(*)的回歸直線分別用黑色和灰色表示，其相應的決定系數(R2)分別標記在回歸直線上側和下側

表1 采用不同類型的隸屬函數生成的ANFIS模型，在訓練和預測階段對沙門氏菌數量預測值的均方根誤差和決定系數Table 1 RMSE and R2 for Salmonella populations byANFIS models generated with different types of inputmembership functions (MFs) at training and predictionphases

為直觀地展示各模型的預測值是否符合實際情況和一般經驗，把不同隸屬函數構建的模型輸出值(即預測值)繪制成曲面，如圖4所示。由圖4可見，各隸屬函數之間差異較大，gaussmf隸屬函數構建的模型，其輸出值的曲面最為平滑，沒有不必要的波動，且不同溫度下的曲線形態與實驗值形態最接近。

圖4 采用不同隸屬函數構建的ANFIS模型輸出值的分布曲面Fig.4 Output surface of ANFIS model with different membership functions

結合圖3、圖4和表1的結果可知，采用gaussmf隸屬函數構建的ANFIS模型的綜合性能優于其他隸屬模型，其輸出值的分布曲面更加符合實驗數值和一般經驗。因此，建議采用gaussmf隸屬函數構建ANFIS模型對處理組進行菌落數量預測，得到的沙門氏菌菌落預測曲線和實驗值如圖5所示。從圖5中可見，在3種儲藏溫度下，預測曲線均能夠準確反映實驗值的變化規律，預測效果較好。

圖5 茶多酚和熱超聲聯合處理后的冬瓜在不同溫度儲藏過程中沙門氏菌數量實驗值及其ANFIS預測值Fig.5 Observed and predicted Salmonella population in fresh-cut wax gourd treated by thermosonication and tea polyphenol during storage at different temperatures

常用的描述微生物生長的數學模型和公式有很多，如Gompertz模型[18]、Baranyi模型[19]和Huang模型[20-21]等。這些模型最適宜的擬合場景是由滯后期、指數期和平穩期組成的S型增長曲線，并且在提供某些函數的物理學或生物學意義方面具有優勢。但是，上述模型具有內在的局限性。其一，這些模型通常用來描述增長曲線，在預測復雜多變的微生物種群曲線方面的應用可能受到限制，如不適用于下降曲線等。這意味著條件發生改變時，需要重新設置模型參數，或者使用多種不同類型的模型進行擬合和預測。其二，操作人員需要具備特定的專業知識，才能理解上述模型中某些關鍵函數和參數的物理學或生物學意義，這對模型的推廣應用帶來了一定的限制。

基于模糊推理建立的ANFIS模型，采用人工神經網絡進行自主學習，使用輸入和輸出的數據對優化各項參數，自動生成因果規則，雖然無法提供明確的公式，但同時也不需要操作人員具有復雜相關背景知識。因此，它可以方便地應用于各種情況，有望成為模擬和預測微生物數量和食品保質期的有力工具。

3 結論

熱超聲和茶多酚聯合處理能夠顯著減少鮮切冬瓜中沙門氏菌的數量，在25、10和4 ℃儲藏過程中，持續抑制冬瓜保鮮過程中沙門氏菌的生長，是一種具有較大應用潛力的蔬菜保鮮技術。本文建立的ANFIS模型，每個輸入變量采用2個隸屬函數，生成8個因果規則，最佳的隸屬函數類型為gaussmf，采用該函數構建的模型RMSE<0.2，R2>0.99，能較好地預測不同貯藏溫度下鮮切冬瓜中沙門氏菌的數量。該模型采用人工神經網絡進行自主學習，自動生成因果規則，不需要操作人員具有復雜相關背景知識，能夠適用于各種微生物增長和衰亡曲線，有望成為預測微生物數量和食品保質期的有力工具。