固定化酶制備鳀魚(yú)蒸煮液蛋白肽及其性能表征

馬瑞娟，林煌華，謝友坪*，陳劍鋒

1(福州大學(xué)，海洋生物高值高質(zhì)化利用技術(shù)創(chuàng)新服務(wù)平臺(tái)，福建 福州,350108) 2(福州大學(xué)，福建省海產(chǎn)品廢棄物綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建 福州,350108) 3(福州大學(xué)，福州市海產(chǎn)品高值化利用行業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，福建 福州,350108)

鳀魚(yú)已經(jīng)成為世界上捕撈量最大的小型魚(yú)種，年產(chǎn)量達(dá)到9 000萬(wàn)t[1]。鳀魚(yú)蒸煮液富含蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素、牛磺酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，但是目前這些蒸煮液大部分被直接排放，造成了一定程度的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

蛋白肽的分子質(zhì)量位于大分子蛋白質(zhì)和氨基酸之間，具有分子量小、易吸收、水溶性佳、穩(wěn)定且安全等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、飼料及肥料中。WASSWA等[3]利用堿性蛋白酶制備草魚(yú)皮蛋白肽；ALEMN等[4]從金槍魚(yú)和大比目魚(yú)皮明膠中制備小分子蛋白質(zhì)；SAMPATH KUMAR等[5]利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和食糜蛋白酶從馬鮫魚(yú)和黃花魚(yú)的皮膚中提取獲得蛋白質(zhì)水解肽。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于利用蒸煮液制備活性蛋白肽的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。

磁性交聯(lián)酶聚集體(magnetic cross-linked enzyme aggregates)技術(shù)是一種相對(duì)較新的酶固定化方法，主要是將交聯(lián)酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates, CLEAs)附著在氨基功能化磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNP)上[6]。將這種氨基官能化的磁鐵礦納米顆粒添加到具有低賴(lài)氨酸殘余物含量的酶溶液中可以制備出高穩(wěn)定性的CLEAs。此外，由于磁鐵礦納米顆粒的磁性，通過(guò)外部施加磁場(chǎng)能將CLEAs與其反應(yīng)混合物分離，可實(shí)現(xiàn)蛋白酶的重復(fù)利用[7]。

本研究制備了磁性中性蛋白酶CLEAs和磁性堿性蛋白酶CLEAs，并以鳀魚(yú)蒸煮液作為原料，利用固定化酶制備蛋白肽。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上運(yùn)用中心組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化酶解工藝，并對(duì)酶解液蛋白肽的氨基酸組成、分子量分布和抗氧化活性進(jìn)行分析，同時(shí)考察固定化酶的重復(fù)利用性。本研究可為促進(jìn)魚(yú)類(lèi)資源高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳀魚(yú)蒸煮液，福州海匯生物科技實(shí)業(yè)有限公司；堿性蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙腈、甲醇均為色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基，上海麥克林生化科技有限公司；FeSO4·7H2O，西隴化工股份有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，上海麥克林生化科技有限公司；三氟乙酸、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、無(wú)水乙醇、正丙醇、NaOH、三氯乙酸、鄰苯三酚、水楊酸等均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756P紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；Sartorius BS 210S電子天平，德國(guó)Sartorius公司；Biochrom30+全自動(dòng)氨基酸分析儀，英國(guó)biochrom公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；ZNCL-TS智能磁力攪拌器，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；THZ-82恒溫水浴振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 磁性CLEAs的制備和重復(fù)利用

MNP的制備和修飾參考AKHOND等[8]和BEDADE等[9]報(bào)道的方法。將1.33 g FeSO4·7H2O和2.59 g FeCl3·6H2O溶解在100 mL去離子水中，用氮?dú)饬鞒パ鯕馐蛊洚a(chǎn)生惰性條件。之后加入6.0 mL氨水(25%質(zhì)量分?jǐn)?shù))攪拌30 min，收集沉淀物，用去離子水(3次)和乙醇(1次)洗滌，即得MNP。將1.38 g MNP懸浮在50 mL乙醇(50%體積分?jǐn)?shù))中，超聲處理30 min后滴加5.55 mL APTES，并在1 000 r/min、50 ℃下回流3 h進(jìn)行MNP修飾。然后在25 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，收集沉淀物用去離子水(3次)和乙醇(1次)洗滌，即得修飾化的MNP，干燥備用。

磁性CLEAs的制備：稱(chēng)取5 mg中性蛋白酶和10 mg堿性蛋白酶，分別用1 mL磷酸緩沖液(pH分別為 7.5、10.5)溶解，加入5 mg修飾化的MNP，混勻。之后加入9 mL乙醇，置于4 ℃冰箱，待蛋白酶完全沉淀后加入體積分?jǐn)?shù)0.2%戊二醛溶液，于4 ℃交聯(lián)4 h。最后使用磁鐵吸附磁性CLEAs，倒掉上清液，凍干備用。

磁性CLEAs的重復(fù)利用：待酶解反應(yīng)結(jié)束后，利用磁鐵將磁性CLEAs吸附，使其從反應(yīng)體系中分離，隨后使用磷酸緩沖液(pH為7.8)洗滌3次，以用于下一次酶解反應(yīng)。

1.3.2 TCA-NSI測(cè)定

以三氯乙酸氮溶解指數(shù)(trichloroacetic acid-nitrogen soluble index，TCA-NSI)為酶解效率的評(píng)價(jià)指標(biāo)，參考鄭志強(qiáng)[10]報(bào)道的TCA方法，測(cè)定酶解液中多肽得率，按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：m0，15%TCA中可溶性氮質(zhì)量，mg；m1，原料中總氮質(zhì)量，mg。

可溶性氮質(zhì)量的測(cè)定參照雙縮脲法[11]，總氮質(zhì)量的測(cè)定參照GB 5009.5—2016的凱氏定氮法。

1.3.3 氨基酸組成測(cè)定和必需氨基酸指數(shù)(essential amino acid index, EAAI)的計(jì)算

參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》測(cè)定氨基酸組成。

EAAI計(jì)算如公式(2)所示[12]：

(2)

式中：aan，樣品中必需氨基酸質(zhì)量占總蛋白質(zhì)量的比例；AAn，F(xiàn)AO/WHO參考標(biāo)準(zhǔn)中必需氨基酸質(zhì)量占總蛋白質(zhì)量的比例[13]。

1.3.4 酶解液分子質(zhì)量分布

參照GB/T 22729—2008。

1.3.5 抗氧化活性研究

1.3.6 酶解工藝優(yōu)化

1.3.6.1 酶解工藝單因素試驗(yàn)

酶解單因素試驗(yàn)的基本條件為：底物質(zhì)量濃度100 g/L、溫度54.5 ℃、酶解時(shí)間1 h、pH 8.2。在此基礎(chǔ)上考察以下單因素的酶解效果：底物質(zhì)量濃度(40、70、100、200、400 g/L)、酶質(zhì)量濃度(0.5、1、2、3、4、5、6 g/L)、溫度(24.5、34.5、44.5、54.5、64.5、74.5 ℃)、pH(5.2、6.2、7.2、8.2、9.2、10.2)、時(shí)間(5、15、30、45、60、90、120 min)、堿性蛋白酶和中性蛋白酶質(zhì)量比例(4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)。每個(gè)因素梯度設(shè)置3次平行試驗(yàn)。

1.3.6.2 酶解工藝響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Benhnken中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，將溫度、pH、復(fù)合酶比例作為試驗(yàn)因素，以TCN-NSI為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的分析試驗(yàn)(表1)，考察固定化酶法制備鳀魚(yú)蒸煮液蛋白肽的最佳工藝組合條件。

表1 中心組合試驗(yàn)自變量因素和水平Table 1 Independent variables and their levels usedin the response surface design

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果由平均值±SD 表示。采用IBM SPSS Statistics 24.0 軟件分析數(shù)據(jù)之間的顯著性，P<0.05說(shuō)明數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝單因素試驗(yàn)

前期研究表明，利用游離態(tài)的堿性蛋白酶與中性蛋白酶酶解鳀魚(yú)蒸煮液的效果最佳[17]。基于此，本研究進(jìn)一步考察固定化堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)蒸煮液酶解效果的影響。從圖1-a可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度一定時(shí)，酶添加量決定了酶與底物的反應(yīng)速度[18]，隨著酶添加量的增加，TCA-NSI逐漸上升，但當(dāng)酶添加量超過(guò)4 g/L時(shí)，TCA-NSI隨之下降。

圖1 不同因素對(duì)TCA-NSI的影響Fig.1 Effect of different factors on TCA-NSI

從圖1-b可知，隨著溫度的上升，TCA-NSI呈先上升后下降趨勢(shì)，這可能是由于隨著溫度的上升，酶活力不斷提高，水解速率加快，但溫度太高可能會(huì)造成酶結(jié)構(gòu)破壞。從圖1-c可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度低于100 g/L時(shí)，TCA-NSI隨底物質(zhì)量濃度增加而上升，但當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過(guò)100 g/L時(shí)，可能由于總氮增加量遠(yuǎn)大于多肽增加量[19]，導(dǎo)致TCA-NSI下降。從圖1-d可知，當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)45 min時(shí)，水解過(guò)程基本可達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。從圖1-e可知，隨著pH提高，酶解效果呈先上升后緩慢下降趨勢(shì)，這主要是由于酶反應(yīng)需要最適pH，極端pH可能會(huì)使得蛋白酶變性，從而影響酶活力[20]。從圖1-f可知，隨著固定化中性蛋白酶比例的增加，TCA-NSI先上升后下降，當(dāng)復(fù)合酶比例為1∶1時(shí)TCA-NSI達(dá)最大值。

2.2 酶解工藝響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

利用Design-Expert 8.0.6將TCA-NSI值與各因素進(jìn)行回歸擬合，得到TCA-NSI對(duì)溫度(A)、酶解pH(B)、復(fù)合酶比例(C)的最佳回歸方程為：Y=76.38-1.24A-2.23B+0.87C-1.61AB-0.12AC-2.11BC-8.55A2-3.09B2-6.07C2，R2=0.985 6。

通過(guò)顯著性檢驗(yàn)和模型變異數(shù)分析，該模型能夠較好預(yù)測(cè)TCA-NSI值(表2)。

表2 回歸方程各項(xiàng)系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)和變異數(shù)分析Table 2 Significance test and analysis of variancecoefficients of regression equation

注：*顯著性差異，P<0.05；**極顯著性差異，P<0.01

等高線(xiàn)形狀反應(yīng)各因素之間的交互是否顯著，若等高線(xiàn)呈橢圓形則表明各因素之間交互顯著，若呈圓形則表明各因素之間交互不顯著[21-22]。由圖2可知，這3組因素的交互作用強(qiáng)弱為：BC>AB>AC，這與表2顯著性檢驗(yàn)結(jié)果相一致。各因素對(duì)酶解效果的影響順序?yàn)椋簆H>溫度>復(fù)合酶比例。

圖2 不同因素兩兩交互對(duì)TCA-NSI影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖Fig.2 Response surface plots and contour plots of interactive effect of different factors on TCA-NSI

2.2.2 工藝條件確定及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

由Design-Expert軟件得到的優(yōu)化工藝條件為：溫度54.14 ℃、pH 7.80、堿性蛋白酶與中性蛋白酶比例1.36∶1。為驗(yàn)證模型的可信度，以及考慮實(shí)際操作的方便性，將驗(yàn)證條件設(shè)計(jì)為：溫度54.10 ℃、pH為7.80、復(fù)合酶比例1.5∶1，重復(fù)驗(yàn)證3次。結(jié)果顯示，響應(yīng)面預(yù)測(cè)得到的TCA-NSI為76.91%，而驗(yàn)證結(jié)果為77.27%，驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)值相近，表明所得回歸模型能夠較好預(yù)測(cè)酶解過(guò)程。

2.3 酶解液蛋白肽氨基酸組成

由表3可知，在酶解液蛋白肽的氨基酸組成中，人體必需氨基酸組成豐富，EAAI值為0.99。

據(jù)報(bào)道，EAAI值>0.95、0.86～0.95、0.75～0.86、≤0.75分別表示蛋白品質(zhì)優(yōu)、良好、可用、不足[23]。因此，所制備的鳀魚(yú)蒸煮液蛋白肽具有較高的蛋白品質(zhì)。此外，藥效氨基酸(包括谷氨酸[25]、甘氨酸[26]、精氨酸[27])的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.68%，高于郭鵬柳等[24]報(bào)道的海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物中藥效氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。綜上可知，該酶解液具有較好的氨基酸組成和蛋白品質(zhì)。

表3 酶解液蛋白肽氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of enzymatic hydrolysate

注：*表示必需氨基酸

2.4 酶解液蛋白肽的分子質(zhì)量分布

由表4可知，經(jīng)固定化酶酶解后酶解液中由10～40個(gè)氨基酸組成的中長(zhǎng)肽鏈(相對(duì)分子質(zhì)量在1 500～5 000 Da)占8.163%，由2～10個(gè)氨基酸組成的小肽鏈(相對(duì)分子質(zhì)量在180～1 500 Da)占82.518%，而游離氨基酸占8.723%，該結(jié)果與游離中性蛋白酶及堿性蛋白酶的酶解結(jié)果相近[27]。因此，固定化酶可將蒸煮液中的大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)水解成小分子多肽。

表4 蒸煮液及酶解液蛋白肽的分子質(zhì)量分布Table 4 Molecular weight distribution of enzymatichydrolysate and anchovy cooking liquid

2.5 酶解液蛋白肽抗氧化活性研究

圖3 不同質(zhì)量濃度的蛋白肽和抗壞血酸對(duì)自由基清除率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of hydrolyzed peptides and ascorbic acid on free radical scavenging rate

2.6 固定化酶重復(fù)利用性研究

磁性CLEAs通過(guò)外部磁場(chǎng)可與反應(yīng)介質(zhì)相分離，從而實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用。由圖4可知，固定化酶重復(fù)利用2次時(shí)TCN-NSI值未顯著降低。當(dāng)重復(fù)利用次數(shù)從2次增加至5次，TCA-NSI值從70.98%降低至35.09%，在重復(fù)利用5次時(shí)TCA-NSI值仍可保持首次使用時(shí)的48%。該結(jié)果表明，所制備的固定化酶具有較好的重復(fù)利用性。

圖4 重復(fù)利用固定化酶對(duì)TCA-NSI的影響Fig.4 Effect of reusing immobilized enzyme on TCA-NSI

3 結(jié)論

本研究利用磁性酶交聯(lián)聚集體技術(shù)制備固定化中性蛋白酶和堿性蛋白酶，優(yōu)化了鳀魚(yú)蒸煮液的固定化酶解條件，并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行性能表征。結(jié)果表明,在最佳酶解工藝條件下鳀魚(yú)蒸煮液的多肽得率可達(dá)77.27%。酶解產(chǎn)物的EAAI值大于0.95，藥效氨基酸及小分子多肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，且具有較強(qiáng)的抗氧化性，可用于開(kāi)發(fā)活性肽產(chǎn)品。此外，所制備的固定化酶可實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，在重復(fù)利用5次后仍具有較高的多肽得率，因此有利于降低生產(chǎn)成本。本研究結(jié)果可為實(shí)現(xiàn)低值魚(yú)蒸煮液的高值化利用提供理論參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。