一種檢測葡萄糖氧化酶活力的新方法

惠瑤瑤，鄭斐，王倩楠，安賢惠*

1(江蘇海洋大學，江蘇省海洋生物資源與生態環境重點實驗室，江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港，222005) 2(南京百斯杰生物工程有限公司，江蘇 南京，211100)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，EC1.1.3.4 GOD)是一種黃素蛋白(flavoprotein)，能夠以分子氧為電子受體，將β-D-葡萄糖催化氧化成葡萄糖酸內酯與過氧化氫(H2O2)[1-3]。葡萄糖氧化酶具有催化效率高、無毒副作用、高度專一性等特點，并能將葡萄糖氧化成葡萄糖酸而起到去除葡萄糖、脫氧、殺菌等效果[4]，因而被廣泛地應用于醫藥生產[5-6]、食品加工[7-10]、飼料添加[11-12]等方面。

目前測定葡萄糖氧化酶的方法主要有滴定法、電化學法和分光光度法[13-16]。滴定法試劑成本低，但反應體系較大，操作繁瑣，靈敏度低，結果誤差較大[16]。電化學法易受溶液中溶氧以及電化學活性物質的干擾，檢測結果不穩定[13]。分光光度法常用的供體有鄰聯茴香胺、4-氨基安替比啉酚類化合物等，存在顯色物質不穩定，標準曲線重復性差，測定值偏低等問題[14]。目前最被廣泛接受的檢測方法是鄰聯茴香胺-辣根過氧化物酶偶聯的分光光度法(雙酶法)，但鄰聯茴香胺存在致癌風險，且辣根過氧化物酶價格較貴，導致檢測成本較高。

本方法借鑒了過氧化氫酶含量檢測方法[17]以及碘-淀粉體系顯色原理[18-21]，以β-D-葡萄糖為底物，利用葡萄糖氧化酶特異性催化作用，生成中間產物過氧化氫；過氧化氫可與鉬酸銨、KI反應生成單質碘；單質碘在酸性條件下與可溶性淀粉反應生成藍色物質，該藍色物質在一定濃度范圍內，顏色深淺與酶活力呈正相關，從而建立一種新的葡萄糖氧化酶活性測定方法——碘-淀粉分光光度法。并與目前酶制劑企業采用較多的雙酶法進行了比較研究。

1 主要儀器與試劑

1.1 主要儀器

Metash UV系列紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；HH-601超級恒溫水浴鍋，金壇市天竟實驗儀器廠；Eppendorf移液器、Eppendorf Centrifuge5424R離心機，艾本德中國有限公司；Mettler ME204E分析天平、Mettler FiveEasy Plus pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Vortex-5渦旋混合儀，其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 主要試劑與溶液配制

葡萄糖(Sigma)；可溶性淀粉(湖州展望藥業有限公司)；鄰聯茴香胺(ACROS)；辣根過氧化物酶(Vetec V900603-100MG)；H2SO4(體積分數95%～98%)。

除特殊說明外，本文所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T 6682—2008中規定的二級水。

1.2.1 乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.2 mol/L)

準確稱取無水乙酸鈉13.90 g，溶于900 mL去離子水中，攪拌至完全溶解，加入乙酸調節pH至5.50，用去離子水定容至1 L。

1.2.2 KI溶液(100 g/L)

準確稱取10.000 g KI，溶于80 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液中(1.2.1)，攪拌至完全溶解，用乙酸-乙酸鈉緩沖液定容至100 mL。避光存儲，現配現用。

1.2.3 葡萄糖溶液(180 g/L)

準確稱取18.000 g葡萄糖，溶于80 mL水中，攪拌至完全溶解，用水定容至100 mL。

1.2.4 鉬酸銨溶液(100 g/L)

準確稱取10.000 g四水合鉬酸銨，溶于80 mL水中，攪拌至完全溶解，用水定容至100 mL。

1.2.5 可溶性淀粉溶液(20 g/L)[22]

準確稱取2.000 g(精確至0.001 g)可溶性淀粉(以絕干計)于燒杯中，用少量水調成漿狀物，邊攪拌邊緩慢加入70 mL沸水中，然后用水分次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱至完全透明，冷卻定容至100 mL。溶液現配現用。

1.2.6 檸檬酸溶液(1 mol/L)

準確稱取一水合檸檬酸21.014 g，溶于80 mL水中，攪拌至完全溶解，用水定容至100 mL。

1.2.7 鄰聯茴香胺溶液(10 g/L)

稱取0.100 g鄰聯茴香胺，加入10 mL甲醇充分溶解，有效期3 d。使用時取1 mL加入到120 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH 5.50)中，混勻備用，現配現用。

1.2.8 辣根過氧化物酶溶液(0.3 g/L)

準確稱取辣根過氧化物酶3 mg，溶于10 mL水中。

1.2.9 H2SO4溶液(200 g/L)

準確稱取200.0 g H2SO4液體，緩慢倒入水中，邊倒邊攪拌，冷卻至室溫，用水定容至1 L。

2 實驗方法

2.1 測定方法與酶活力計算

2.1.1 碘-淀粉分光光度法

(1)標準曲線的制作

對市售體積分數30%過氧化氫溶液進行標定后，用水稀釋配制成質量濃度(ρ)分別為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL(n=7)的過氧化氫標準液。取潔凈試管7支，依次編號0～6。在試管中依次加入2.5 mL KI溶液、0.3 mL葡萄糖溶液、0.1 mL鉬酸銨溶液、0.1 mL淀粉溶液以及0.1 mL上述不同質量濃度過氧化氫標準溶液，混勻后加入2 mL檸檬酸溶液。在570 nm處用1 cm光徑比色皿比色，以0號管為對照，記錄不同質量濃度過氧化氫標準液對應的吸光值。以顯色體系中過氧化氫終質量濃度(ρ/51)為橫坐標，對應吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

(2)樣品的測定

取潔凈試管若干，在試管中依次加入2.5 mL KI溶液、0.3 mL葡萄糖溶液、0.1 mL 鉬酸銨溶液、0.1 mL 淀粉溶液，混勻置于37℃水浴中預熱3 min，間隔加入0.1 mL樣品稀釋液，準確計時反應3 min。加入2 mL檸檬酸溶液結束反應。分光光度計570 nm可見光下使用1 cm光徑比色皿比色。空白管以0.1 mL緩沖液或熱失活的酶液代替。

酶活性定義：在37 ℃、pH 5.50條件下，每分鐘從0.1 mol/L 的β-D-葡萄糖溶液體系中釋放出1 μmol 過氧化氫，即為1個葡萄糖氧化酶活力單位(U)。

酶活力按公式(1)計算：

(1)

式中：酶活力單位為 U/g或U/mL；ΔA，樣品吸光值與空白吸光值的差值；K，H2O2標準曲線斜率；b，H2O2標準曲線截距；3，酶促反應時間，min；34，H2O2質量濃度，g/L；5.1，反應體系總體積，mL；0.1，加樣量體積，mL；N，試樣總稀釋倍數。

2.1.2 雙酶法

取潔凈試管若干，在試管中依次加入2.5 mL鄰聯茴香胺溶液，0.3 mL 葡萄糖溶液，0.1 mL 辣根過氧化物酶溶液，混勻置于37℃水浴中預熱3 min，間隔加入0.1 mL樣品稀釋液，準確計時反應3 min，加入2 mL H2SO4溶液終止反應。分光光度計460 nm可見光下使用1 cm光徑比色皿比色。

酶活力按公式(2)計算：

(2)

式中：葡萄糖氧化酶的活性單位為U/g或U/mL；ΔA,樣品吸光值與樣品空白吸光值的差值;5,反應體系總體積，mL；3,反應時間，min；0.1,加樣量體積，mL；m,樣品質量或體積，g或mL；F,體積稀釋倍數(試樣總稀釋倍數N=F/m)；11.3,消光系數，mL/(μmol·cm)。

2.2 實驗樣品處理

市售葡萄糖氧化酶固體樣品1個，實驗室搖瓶發酵液體樣品1個以及市售葡萄糖氧化酶液體樣品1個，編號為S1、S2、S3。

葡萄糖氧化酶固體樣品首先需要預處理，即用乙酸-乙酸鈉緩沖液(1.2.1)稱取質量稀釋50倍，磁力攪拌器渦旋10 min，10 000 r/min條件下離心5 min，取上清液進行后續體積稀釋，完成后編號備用。液體酶制劑直接用乙酸-乙酸鈉緩沖液進行體積稀釋，完成后編號備用。

3 結果與分析

3.1 碘-淀粉分光光度法

3.1.1 碘-淀粉分光光度法標準曲線的繪制

按照2.1.1方法繪制碘-淀粉標準曲線，得到標準曲線方程Y=0.789 3X-0.047 9，r=0.999 7。其中X為顯色體系中過氧化氫終濃度，Y為對應吸光值，r為相關系數。

3.1.2 碘-淀粉分光光度法測定供試樣品

碘-淀粉分光光度法檢測樣品S1、S2和S3的酶活力結果依次為6 753、2 986、10 842 U/mL；體系吸光值有效范圍在0.1～0.6。葡萄糖氧化酶濃度控制在0.1～0.5 U/mL時，檢測平行性良好，相對酶活力檢測偏差在5%以內，結果如表1、表2和表3所示。

3.2 碘-淀粉分光光度法與雙酶法的比較

3.2.1 兩種方法檢測結果比較

碘-淀粉分光光度法酶活力測定值顯著高于雙酶法。分析表1、表2和表3可知，碘-淀粉分光光度法的檢測值約為雙酶法的2～3倍。比較2組方法對同一組樣品的檢測結果，可以看出碘-淀粉分光光度法更容易檢出樣品中的葡萄糖氧化酶成分。

3.2.2 兩種方法吸光值有效范圍比較

將同一份樣品進行梯度稀釋，得到梯度酶濃度稀釋液。在酶促反應體系中，隨著酶濃度增大，酶活計算結果呈降低趨勢。呈現該趨勢的主要原因是隨著酶活力增大，底物對于酶活力不再絕對過量，反應對準一級反應動力學有所偏離[16]。分析表1～表3，碘-淀粉分光光度法在檢測固體樣品S1、發酵液樣品S2以及液體成品S3時，酶促反應體系與H2O2響應曲線在0.1～0.6的吸光值區間匹配良好，酶活力檢測結果相對偏差5%以內；雙酶法在吸光值0.1～0.2附近檢測結果良好，酶活力計算結果相對偏差10%以內。對于成分組成不同的樣品，吸光值范圍略有波動。

表1 兩種方法同時檢測固體樣品S1的數據比較Table 1 Comparison of two methods for simultaneousdetermination of solid sample S1

注：碘-淀粉分光光度法酶活力計算結果相對偏差超出5%時，數據加括號以示區別。雙酶法酶活力計算結果相對偏差超出10%時，數據加括號以示區別，加括號數據不納入表格參數計算;“-”：超出分光光度計儀器可信區間(0.1～0.8)，未計入檢測數據(下同)

3.2.3 兩種方法顯色靈敏度比較

以表2發酵液檢測結果為例，2種方法同時測定編號為9 ～ 12對應的酶梯度稀釋液時，碘-淀粉分光光度法隨著稀釋倍數增大，吸光值由0.857遞減至0.468，而雙酶法從0.190遞減至0.100。比較吸光值遞減程度可知，碘-淀粉分光光度法的顯色靈敏度高于雙酶法。

綜合表1～表3，碘-淀粉分光光度法酶活力計算結果的變異系數RSD均低于雙酶法，說明碘-淀粉分光光度法的檢測精確度高于雙酶法。碘-淀粉分光光度法的最小檢測限遠低于雙酶法，更有利于研發階段對基因改造后酶蛋白微量表達菌株的篩選工作。

表2 兩種方法同時檢測搖瓶發酵液體樣品S2的數據比較Table 2 Comparison of two methods for simultaneousdetection of liquid sample S2 in shaking flaskfermentation

表3 兩種方法同時檢測液體樣品S3的數據比較Table 3 Comparison of two methods for simultaneousdetection of liquid sample S3

3.3 其他

實驗中發現，雙酶法的檢測受辣根過氧化物酶影響較大，不同廠家和批號的辣根過氧化物酶，其檢測結果和檢測穩定性差異明顯；碘-淀粉分光光度法檢測誤差與淀粉的選取有一定關系，本文實驗選取湖州展望藥業有限公司生產的酶制劑檢測專用可溶性淀粉，配制過程中煮沸時間定為2～3 min，獨立重復實驗(n≥3)結果平行性良好。

4 結論

本文利用碘-淀粉顯色體系建立了一種新的分光光度法檢測葡萄糖氧化酶活力，體系吸光值有效范圍在0.1～0.6附近。反應體系在葡萄糖氧化酶濃度為0.1～0.5 U/mL范圍時，檢測平行性良好，獨立重復實驗酶活力計算結果相對偏差在5%以內。碘-淀粉分光光度法所用試劑均為常見試劑，檢測通量較高，檢測精度滿足需求，檢測成本較低，通過反復驗證，酶活力反應體系實用可靠。