QuEChERS凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定凱特芒果中14種農(nóng)藥殘留

田金鳳,尚遠(yuǎn)宏

(攀枝花學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，四川 攀枝花，617000)

芒果(MangiferaindicaLinn.)是漆樹科杧果屬的多年生植物[1]，其果實享有熱帶果王之稱[2-3]。目前，攀枝花市的芒果上市時間較國內(nèi)其他產(chǎn)區(qū)晚2～3個月，凱特芒果種植總面積在全市芒果種植中接近70%[4]，且凱特芒果作為晚熟品種占比最大[5]，具有較強的市場競爭力。同時，中國是世界最大芒果消費國和主要生產(chǎn)國，但我國芒果農(nóng)藥種類和農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)少，針對性不強[6]；隨著進(jìn)出口貿(mào)易逐年加大，如何使國家在制修訂農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)時，既符合貿(mào)易國的芒果進(jìn)出口的規(guī)定，又要保護國內(nèi)芒果生產(chǎn)，高度重視芒果質(zhì)量安全問題變得非常重要。

我國芒果主要分布在海南、臺灣、四川和廣東等熱帶亞熱帶地區(qū)，該地區(qū)具有高溫高濕的氣候特點，且芒果缺乏優(yōu)良的抗病品種[7]，使得在芒果上發(fā)生的病蟲害較為普遍。芒果生產(chǎn)過程中農(nóng)藥施用不合理，造成芒果產(chǎn)品農(nóng)藥殘留問題日益凸顯，導(dǎo)致其安全性和食用性均受到影響。2020年2月15日將正式實施的GB 2763—2019中，規(guī)定芒果專屬的農(nóng)藥27種(表1)[8]，包含11種殺蟲劑，14種殺菌劑和2種植物生長調(diào)節(jié)劑。標(biāo)準(zhǔn)中，除芒果專屬的農(nóng)藥(1種殺菌劑“咪鮮胺和咪鮮胺錳鹽”及1種殺蟲劑“氰戊菊酯和S-氰戊菊酯”)之外，有“皮不可食的熱帶和亞熱帶水果”要求的芒果非專屬(間接)的農(nóng)藥47種，含44種殺蟲劑和3種除草劑。目前，我國尚未對三唑酮、丙環(huán)唑、嘧霉胺、甲霜靈、烯酰嗎啉、惡霜靈、腈菌唑等7種殺菌劑和氧樂果、克百威、三羥基克百威3種殺蟲劑在芒果中殘留限量做出規(guī)定，也無對其殘留測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，探討并建立同時檢測芒果中14種農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)具有實際意義。

表1 中國的芒果專屬的農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)限量Table 1 Maximum residue limits(MRL)to pesticides in mango of China

注：*表示該限量為臨時限量

目前，現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 20769—2008有水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留量分析的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，但該方法前處理操作繁瑣、成本高、費時費力，不適合大批量樣品的快速定性及定量分析[9]。而國內(nèi)外也有利用氣相色譜法和液相色譜法等方法檢測芒果中農(nóng)藥殘留的報道[10-12]，常采用傳統(tǒng)的固相萃取或液液萃取的前處理凈化方法，存在操作繁瑣、消耗時間長等不足，不適用于高通量檢測芒果中農(nóng)藥殘留。同時，芒果的基質(zhì)成分復(fù)雜，特別是攀枝花的凱特芒果甜度高、含糖量大，分離分析難度大，檢測干擾嚴(yán)重。尚未見同時檢測凱特芒果中多菌靈、三唑酮、戊唑醇、丙環(huán)唑、嘧霉胺、甲霜靈、烯酰嗎啉、苯醚甲環(huán)唑、惡霜靈、腈菌唑、吡唑醚菌酯等11種殺菌劑和氧樂果、克百威、三羥基克百威3種殺蟲劑的殘留報道。高通量檢測蔬菜及水果中農(nóng)藥多殘留的最有效和快速的前處理凈化方法是QuEChERS法[13]。QuEChERS技術(shù)具有快速、高效等優(yōu)點，被廣泛運用于農(nóng)藥殘留分析的前處理過程中。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高通量、高選擇性和高靈敏度等特點，是農(nóng)藥殘留分析的熱點技術(shù)之一[14-15]。但QuEChERS方法在結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析時，樣品提取溶劑及量的變化會造成環(huán)境污染和溶劑效應(yīng)，本文對提取溶劑、體積和提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，提高了方法的適用性。

食品中農(nóng)藥最大殘留限量新標(biāo)準(zhǔn)的實施，對于芒果農(nóng)殘檢測的數(shù)量增多和限量要求越來越嚴(yán)格，因此通過有效的技術(shù)手段，對芒果中的有關(guān)藥物殘留進(jìn)行檢測，以確保人類對芒果消費的安全，具有十分重要的意義。本文以凱特芒果為研究對象，優(yōu)化了QuEChERS前處理條件、色譜條件和質(zhì)譜條件等，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定凱特芒果中14種農(nóng)藥殘留，其方法準(zhǔn)確可靠，操作簡易，回收率穩(wěn)定，能滿足日常凱特芒果農(nóng)藥殘留的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凱特芒果，攀枝花地區(qū)市售或采摘晚熟凱特芒果；甲酸、甲醇(色譜級) Fisher公司；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：多菌靈、嘧霉胺、甲霜靈、烯酰嗎啉、三唑酮、戊唑醇、丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、氧樂果、克百威、三羥基克百威、惡霜靈、腈菌唑、吡唑醚菌酯，純度均大于98%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

Agilent 6460A超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，美國Agilent 公司；1-14k離心機，Sigma公司；FA2014B電子天平，上海越平公司；Milli-Q IQ7000超純水器，美國Millipore公司；VORTEX 4渦旋混合器，LMS公司；NEVAP-45氮吹儀，美國Organomation公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量14種標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃避光保存。其他濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇定量稀釋即得。

1.2.2 樣品前處理

芒果去皮去核取可食用部分，稱取10.0 g芒果樣品(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯刻度離心管中，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸乙腈溶液[16]，振蕩渦旋20 min，加入NaCl 1 g和無水MgSO45 g[17]，立即渦旋混勻10 s，然后10 000 r/min離心5 min，取上清液5.0 mL，加入QuEChERS試劑管中渦旋混勻1 min，再10 000 r/min離心3 min，取上清液0.5 mL，用水定容至1 mL，混勻后14 000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜，即得。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相4 mmol/L甲酸水溶液-甲醇[18]，梯度洗脫；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL；柱溫30 ℃；洗脫方式:梯度洗脫，洗脫程序0～7.5 min，甲醇由體積分?jǐn)?shù)30%升至90%；7.5～10 min，甲醇為90%；10～10.5 min，甲醇由90%降至30%；10.5～15 min，甲醇為30%。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)；霧化氣壓力45 psi；輔助氣流速11 L/min；輔助氣溫度300 ℃；電噴霧電壓4 000 V。

14種農(nóng)藥的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測模式下14 種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS conditions under MRM mode of the 14 pesticide residues

1.2.4 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

配制好的 14種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋成400 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白芒果基質(zhì)提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成200、100、80、40、20、10、4 μg/L系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，采用外標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10) 分別確定檢出限(limit of detection, LOD)與定量限(limit of quantitation, LOQ)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

實驗對比ZORBAX-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和核殼柱Poroshell 120 EC- C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)，分別對14種質(zhì)量濃度為100 μg/L的目標(biāo)化合物進(jìn)樣，優(yōu)化其色譜和質(zhì)譜條件。結(jié)果顯示，使用ZORBAX-C18柱適用性好，出峰均勻，峰形尖銳，分離度好；而流動相中加入少量酸能夠達(dá)到改善峰形、提高分離效率的作用，并且化合物更容易離子化，提高靈敏度；同時，在子離子掃描模式下，優(yōu)化碰撞能量，得到相應(yīng)的離子碎片。14種農(nóng)藥的MRM色譜圖見圖1，二級離子質(zhì)譜圖見圖2。

圖1 100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 100 μg/L mixed standardsolution

圖2 14種農(nóng)藥的二級離子質(zhì)譜圖Fig.2 MS /MS spectra of the 14 pesticide residues注：a～n分別對應(yīng)表2中1～14農(nóng)藥

2.2 提取條件的優(yōu)化

樣品前處理參照文獻(xiàn)[16]方法適當(dāng)改進(jìn)，分別采用8、10、12 mL 0.5%甲酸乙腈和乙腈溶液提取進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14 種農(nóng)藥經(jīng)10 mL 0.5%甲酸乙腈溶液提取1次效果最好，而且提取次數(shù)的增加并不會引起提取率顯著提高，達(dá)到節(jié)約試劑和減少環(huán)境污染，且用乙腈溶液提取比0.5%甲酸乙腈提取的雜質(zhì)多。同時，樣品前處理過程中用無水MgSO4和NaCl作為除水劑，NaCl加大水中的離子強度，因鹽析作用將樣品中水層和有機試劑乙腈層分離，而無水MgSO4和水分子結(jié)合來起到除水作用。

2.3 方法的線性關(guān)系及檢出限

14種農(nóng)藥的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限見表3。14種農(nóng)藥在4.0～200.0 μg/L線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)均>0.999，LOQ為0.15～1.0 μg/kg，均低于中國和歐盟規(guī)定的最大殘留限量值[6]。同時，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法中含14種農(nóng)藥殘留以適用于“芒果”、“其他食品”或“其他蔬菜和水果”可參照執(zhí)行的檢測方法相比，GB 23200.8—2016中規(guī)定甲霜靈的LOQ為0.037 6 mg/kg、三唑酮為0.025 0 mg/kg、腈菌唑為0.012 6 mg/kg、丙環(huán)唑為0.037 6 mg/kg、惡霜靈為0.012 6 mg/kg、戊唑醇為0.037 6 mg/kg[20]；GB 23200.34—2016中吡唑醚菌酯和3-羥基克百威的LOQ均為0.005 mg/kg[21]；GB 23200.49—2016中苯醚甲環(huán)唑的LOQ為0.005 mg/kg[22]；NY/T 1453—2007中多菌靈的LOQ為0.02 mg/kg[23]；SN/T 0519—2010中丙環(huán)唑的LOQ為0.01 mg/kg[24]；GB 23200.46—2016中腈菌唑的LOQ為0.01 mg/kg[25]。均比本文中14種相應(yīng)農(nóng)藥的殘留LOQ規(guī)定值大。本方法具備了更靈敏的定量檢測能力，解決了芒果中農(nóng)藥檢測的問題，對芒果的農(nóng)殘檢測具有一定專屬性，能滿足凱特芒果中14種農(nóng)藥殘留檢測的要求。

表3 14種農(nóng)藥的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear regression equations, correlation coefficients and detection limits of 14 pesticides

注：克百威及3-羥基克百威之和，以克百威表示殘留物

2.4 方法的回收率與精密度

以5、20、100 μg/kg的水平將14種農(nóng)藥添加到空白凱特芒果基質(zhì)中，測定回收率，結(jié)果見表4。

表4 14種農(nóng)藥的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD) of the 14 pesticides (n=6)

續(xù)表4

序號組分名添加水平/(μg·kg-1)回收率/%RSD/%9三唑酮5, 20, 10092.5, 94.9, 98.35.8, 6.9, 8.310腈菌唑5, 20, 10087.7, 91.8, 94.14.1, 5.5, 6.311戊唑醇5, 20, 10090.4, 94.8, 98.14.8, 5.9, 8.912丙環(huán)唑5, 20, 10088.5, 96.8, 103.16.1, 9.7, 11.213吡唑醚菌酯5, 20, 10086.9, 93.6, 98.35.1, 6.9, 7.814苯醚甲環(huán)唑5, 20, 10094.2, 98.8, 100.45.3, 8.6, 9.8

14種農(nóng)藥在凱特中的回收率范圍為86.5%～103.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～11.5%，回收率與精密度滿足農(nóng)藥定量分析要求[26]。

3 結(jié)論

本文結(jié)合固相萃取技術(shù)，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了凱特中14種農(nóng)藥殘留的分析測定方法。該方法前處理操作簡單，凈化效果好，靈敏度高，干擾少，其LOQ 可達(dá)到0.15 μg/kg，凱特芒果樣品中14 種農(nóng)藥均未檢出，在實際檢測中具有較強的可行性和實用性，也適用于芒果各品種中14種農(nóng)藥殘留的定性和定量分析，且對于即將實施的GB 2763—2019標(biāo)準(zhǔn)的完善芒果中多種農(nóng)藥殘留的檢測方法和限量標(biāo)準(zhǔn)的制定是十分必要的。