趨化素樣因子超家族成員6在膠質瘤中的表達及臨床意義①

韋 俐 楊小駿 王 琦 鄭 曉 徐 斌 蔣敬庭 (蘇州大學附屬第三醫院腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術中心，蘇州大學細胞治療研究院，常州 213003)

腦膠質瘤在所有顱內腫瘤中發生率最高，五年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌。最大范圍手術切除和術后放化療是目前膠質瘤的標準治療方案，但效果欠佳。近年來，免疫治療和靶向治療在惡性腫瘤中的應用取得了進展，其中研究較多的是PD-1/PD-L1免疫抑制信號通路。趨化素樣因子超家族成員6(chemokine-like factor 6，CMTM6)作為CMTM家族的一員，參與腫瘤的免疫應答，是PD-L1的關鍵調控因子[1]。本研究采用免疫組化、免疫熒光、Western blot和qRT-PCR，檢測腦膠質瘤組織及膠質母細胞瘤細胞系中CMTM6的表達，分析其與臨床病理特征及預后生存之間的關系，為膠質瘤的免疫靶向治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本 收集蘇州大學附屬第三醫院2018年1月～2019年6月經病理確診及手術切除的膠質瘤組織樣本46例(切除深部良性腫瘤手術入路中必須切除的表面無功能皮層組織)，其中低級別組14例(WHOⅠ～Ⅱ級)、高級別組32例(WHOⅢ～Ⅳ級)，正常對照腦組織9例，所有樣本采集通過蘇州大學附屬第三醫院倫理委員會審核。

1.1.2試劑 CMTM6 Antibody(NBP1-31183,Nov-us)；GFAP、DAPI(GB12096/G1012,Service)；HRP偶聯二抗(Bioworld)；引物(Servicebio)。

1.1.3標準細胞系 人膠質母細胞瘤細胞系U87和U251(中科院上海細胞研究所)，人腦正常膠質細胞系HEB(中科院典型培養物保藏委員會細胞庫)。

1.1.4組織芯片 人腦膠質瘤組織芯片HBraG171 Su01(上海芯超生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色 術中取組織經甲醛固定、石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復、封閉等處理后，加CMTM6一抗(1∶200稀釋)，4℃過夜；加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，樹膠封片。由兩位病理科高年資醫師雙盲讀片，H-score評分。

1.2.2免疫熒光雙染 組織切片脫蠟、水化、抗原修復、畫圈自發熒光淬滅，血清封閉，加一抗(GFAP/CMTM6)，濕盒4℃過夜。加二抗(CY3/488)，DAPI染核，封片，鏡檢拍照。紅光(CMTM6)和綠光(GFAP)重合部分為陽性表達。

1.2.3Western blot 提取待測組織和細胞總蛋白，BCA定量，4∶1加入SDS PAGE凝膠電泳(5×)，轉膜，全蛋白封閉。加CMTM6一抗(1∶1 000)，4℃過夜。轉移條帶至相應HRP偶聯二抗(1∶5 000)，化學曝光。Image J軟件分析CMTM6蛋白表達量。

1.2.4qRT-PCR 提取待測組織和細胞總RNA。逆轉錄，定量PCR。反應體系25 μl，條件為：95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，循環40次，溶解曲線60～95℃，每15 s升溫0.3℃。β-actin為內參，重復3次取平均值，記錄Ct值，計算CMTM6 mRNA相對表達量(ΔΔCT法)。引物序列見表1。

2 結果

2.1CMTM6在膠質瘤組織中的表達上調 在膠質瘤組織中CMTM6蛋白和CMTM6 mRNA的表達水平均顯著高于正常腦組織(P<0.01)，不同病理級別膠質瘤組織對比，高級別膠質瘤組織中的CMTM6蛋白和CMTM6 mRNA的表達水平明顯上調(P<0.05)，見圖1A～C。免疫組化染色結果顯示，CMTM6蛋白特異性表達于膠質細胞的胞漿和胞膜，在膠質瘤組織中CMTM6陽性表達率顯著高于正常腦組織，高級別膠質瘤組織中CMTM6陽性表達率明顯上調，見圖1D。免疫熒光雙染發現，膠質瘤組織中的CMTM6陽性細胞數量明顯增加，且熒光強度增強，見圖1E。

2.2CMTM6在膠質母細胞瘤細胞系中表達上調人腦正常膠質細胞系(HEB)中CMTM6 mRNA的表達水平顯著低于膠質母細胞瘤細胞系(U87、U251)(P<0.01)，見圖2A。在U87、U251中，CMTM6蛋白的轉錄和表達量明顯高于HEB，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2B。

表1 CMTM6、β-actin引物序列

Tab.1 CMTM6 and β-actin primer sequence

GeneSequence(5'-3')CMTM6Forward5'-AGTGCCTTTCTTCTGAGTCTCCTT-3'Reverse5'-CTTCAGCCCTAGTGGTATTTTCAG-3'β-actinForward5'-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3'Reverse5'-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3'

圖1 CMTM6在膠質瘤組織中的表達Fig.1 Expression of CMTM6 in glioma tissuesNote:A.H-score semi-quantitative expression of CMTM6;B.CMTM6 mRNA expression was detected by qRT-PCR;C.Expression of CMTM6 protein was detected by Western blot;D.Expression of CMTM6 in human glioma tissues(immunohistochemical staining,HE,×100,×200,×400,scale:100 μm,50 μm,25 μm);E.Expression of CMTM6 in human glioma tissues(immunofluorescence double staining,×200)，red:CMTM6 positive cells;green:glial cells;blue:nucleus.Compared with normal,**.P<0.01;compared with Low-grade,*.P<0.05.

2.3CMTM6表達上調與膠質瘤患者病理分級呈正相關 膠質瘤組織芯片進行免疫組化染色，見圖3。以cut-off值40.9為截點，定義H-score>40.9為高表達，H-score≤40.9為低表達。CMTM6的表達水平與病理分級相關(χ2=7.238,P=0.007)，但與患者的性別、年齡、腫瘤直徑以及周圍組織是否浸潤無相關性(P>0.05)，見表2。

2.4CMTM6表達上調與膠質瘤預后不良相關 CMTM6高表達患者的總生存期和無病生存期均比低表達患者明顯縮短(OS:P=0.002;DFS:P=0.007)，見圖4。CMTM6高表達患者的五年累積總生存率和無病生存率(OS:64%;DFS:47%)較低表達患者(OS:86%;DFS:68%)呈明顯下降趨勢，見圖5。多因素Cox回歸分析顯示，年齡(OS:HR=3.946,P<0.001;DFS:HR=2.605,P<0.001)、病理分級(OS:HR=13.937,P<0.001;DFS:HR=6.118,P<0.001)及CMTM6的表達(OS:HR=2.504,P=0.017;DFS:HR=1.603,P=0.047)都是評判膠質瘤預后的獨立危險因素，見表3～4。

圖2 膠質母細胞瘤細胞系中CMTM6的表達Fig.2 Expression of CMTM6 in glioblastoma cell linesNote:A.CMTM6 mRNA expression was detected by qRT-PCR;B.Expression of CMTM6 protein was detected by Western blot.Compared with HEB，**.P<0.01.

圖3 膠質瘤組織芯片中CMTM6的表達Fig.3 Expression of CMTM6 in glioma tissue microarrayNote:Immunohistochemistry staining,H&E,×50,×200,×400,scale:200 μm,50 μm,25 μm.

表2 膠質瘤組織芯片中CMTM6表達與臨床病理特征的關系

Tab.2 Correlation between CMTM6 expression and clinicopathological characteristics in glioma tissue microarray

ClinicopathologicalfeaturesnCMTM6H-score>40.9H-score≤40.9χ2PSex0.0720.789Male1097732Female624319Age(year)2.4110.120<40744826≥40977324Tumor diameter0.0250.518≥4 cm1118229<4 cm604317Peripheral infiltration0.1780.430Yes463511No1258936Tissue classification7.2380.0071)Ⅰ-Ⅱ996237Ⅲ-Ⅳ725913

Note:1)P<0.05.

圖4 CMTM6的表達與膠質瘤患者生存預后的相關性Fig.4 Correlation between expression of CMTM6 and survival and prognosis of glioma patientsNote:A.Correlation between CMTM6 expression and total postoperative survival of glioma patients，P=0.002；B.Correlation between CMTM6 expression and disease-free postoperative survival in glioma patients，P=0.007.

表3 膠質瘤患者總生存期影響因素Cox回歸分析

Tab.3 Cox regression analysis of factors influencing total survival of glioma patients

Clinical parametersSingle factor CoxHR95%CIP-valueMultiariable CoxHR95%CIP-valueSexMale/Female1.483 0.841-2.6160.174 1.819 1.009-3.2790.064Age(year)≥40/<403.201 1.723-5.946<0.001)3.946 2.056-7.575<0.0011)Tissue classificationⅢ-Ⅳ/Ⅰ-Ⅱ13.956 6.578-29.608<0.0011)13.937 6.519-29.795<0.0011)CMTM6 expressionHigh/Low3.0271.431-6.4010.0041)2.5041.177-5.3240.0171)

Note:1)P<0.05.

表4 膠質瘤患者無病生存期影響因素Cox回歸分析

Tab.4 Cox regression analysis of factors influencing disease-free survival in glioma patients

Clinical parametersSingle factor CoxHR95%CIP-valueMultiariable CoxHR95%CIP-valueSexMale/Female1.374 0.888-2.1250.154 1.555 0.995-2.4320.053 Age(year)≥40/<402.402 1.538-3.753<0.0011)2.605 1.647-4.120<0.0011)Tissue classificationⅢ-Ⅳ/Ⅰ-Ⅱ6.263 3.997-9.814<0.0011)6.118 3.880-9.646<0.0011)CMTM6 expressHigh/Low2.1361.275-3.5810.0041)1.6030.955-2.6930.0471)

Note:1)P<0.05.

圖5 膠質瘤患者五年累積總生存率及無病生存率變化趨勢Fig.5 Trend of 5-year cumulative total survival rate and disease-free survival rate in glioma patientsNote:A.Trend of 5-year cumulative total survival in glioma patients;B.Trend of 5-year cumulative disease-free survival rate in glioma patients.

3 討論

CMTM6是一種成簇存在于染色體3p22上，含有MARVEL結構域的免疫相關非特異性蛋白。和家族其他成員一樣，CMTM6廣泛表達于各類組織細胞表面，也是多種腫瘤的抑制位點，其編碼的產物蛋白可以激活和趨化免疫細胞，通過調控細胞周期和信號通路，在腫瘤的發展和轉移中起重要作用[2-4]。有研究報道，CMTM6的異常表達與肝細胞癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和腦膠質瘤等腫瘤的發生發展有關[5-8]。

膠質瘤的邊界不清，多呈浸潤性生長，具有很強的增殖侵襲能力和化療耐受性[9]。盡管近年來手術和影像定位技術不斷進步，化療藥物及放療技術不斷更新，但仍不能避免膠質瘤的復發[10]，患者平均中位生存期不超過14.6個月[11]。因此，探索膠質瘤的臨床治療新方法成為研究熱點。目前，FDA已經批準腫瘤免疫和靶向治療用于黑色素瘤和非小細胞肺癌等腫瘤，在臨床治療上展現出了廣闊的前景。研究證實，中樞神經系統并非是“免疫豁免”區[12]，也存在淋巴管和完整的免疫調控系統。另外，膠質瘤浸潤性生長會破壞人血腦屏障的完整性，使淋巴細胞更容易進出腦組織[13]，而趨化因子的存在也可以幫助淋巴細胞穿過血腦屏障[14]。

國外研究報道，CMTM家族中的多個基因和膠質母細胞瘤有密切關系，其中CMTM6在膠質母細胞瘤中高表達[15]。本研究顯示，CMTM6在膠質瘤中高表達，且在高級別組中表達高于低級別組，與既往研究結果相符。另有學者通過轉錄組和基因組數據庫分析，發現CMTM6在膠質瘤中表達顯著上調，且與患者存活時間減少有關[7]。我們通過對膠質瘤組織芯片的免疫組化結果進行分析，發現CMTM6的表達與患者總生存期和無病生存期均有關，CMTM6表達越高，患者的生存期越短，與上述研究結果一致。因此，CMTM6可作為一個獨立危險因子來評估膠質瘤患者的預后。

PD-1/PD-L1是通過抑制T細胞增殖活化來負性調控人體免疫應答的免疫抑制信號通路，目前已成為腫瘤治療的研究焦點。雖然Burr等[6]通過全基因組CRISPR-Cas9發現CMTM6作為PD-L1的關鍵調控因子，在多種腫瘤細胞中維持其有效表達，阻止其成為溶酶體降解的靶點，但在膠質瘤中的具體作用機制尚不明確。未來，以CMTM6為靶點阻斷PD-1/PD-L1信號通路或可成為膠質瘤治療的一個新的方向[16]。我們將通過構建慢病毒載體轉染細胞系進行細胞功能及PD-L1調控機制實驗，深入探究CMTM6與膠質瘤復雜的免疫應答間的關系。