腎癌DC-CIK免疫治療對相關細胞因子的影響①

李 悅 尹秀艷 劉婉露 祁麗麗 (牡丹江醫學院附屬紅旗醫院，牡丹江 157011)

近年來，惡性腫瘤的發病率呈不斷上升趨勢，每年以2%～3%的速度增長，預計到2020年，全球患惡性腫瘤的人數將高達2 000萬，致死率將達60%[1，2]。惡性腫瘤具有生長快、易出血、易復發等特點，目前治療方式主要是手術切除、化療、放療、靶向藥物治療、免疫治療以及中醫中藥治療[3，4]。

腎癌是泌尿系統常見惡性腫瘤，初診時就有約20%患者發生轉移，約30%患者在術后發生轉移[5]。腎癌是強免疫性腫瘤，術后干預是重要的輔助治療手段，免疫治療是腎癌術后干預的主要手段[6]。研究發現，IFN和IL-2對腎癌的轉移有效，但治愈率偏低，并不能有效延長患者的生存期[7]。如何降低腎癌術后復發率，改善患者預后，一直是腎癌治療的棘手問題[8]。研究發現DC-CIK細胞免疫治療法對腎癌術后的輔助治療具有很好的療效[9]。

樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是人體內功能最強大的抗原呈遞細胞(antigen presenting cells,APC)，誘導抗原特異性細胞T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)形成，提高人體免疫力[10]。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cells,CIK)是體外通過多種細胞因子培養人外周血中單個核細胞從而獲得的一群異質細胞，具有T淋巴細胞的強大抗腫瘤活性，同時具有非限制性殺傷腫瘤的特點[11]。體內回輸免疫活細胞的免疫療法是腎癌腫瘤治療中重要的輔助治療方法[12]。腎癌術后，在患者體內回輸DC和CIK細胞，能夠產生大量T淋巴細胞，增加機體免疫力，殺傷腫瘤細胞，達到對腎癌的術后干預治療，抑制腫瘤細胞復發[13]。DC和CIK是免疫治療的兩個部分，前者是通過刺激T淋巴細胞的產生，使機體獲得免疫能力，后者是通過自身的細胞毒性和分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，將二者有效結合，能夠產生雙重免疫療效[14]。

目前研究認為，抗腫瘤免疫治療的基礎是產生T細胞介導的免疫應答反應，而在控制免疫原性腫瘤細胞的生長中，CD8+T淋巴細胞是產生免疫應答反應的主要細胞，CD4+T細胞主要是通過分泌各種細胞因子來輔助、誘導并激活CD8+CTL細胞，CD3+T細胞是CIK細胞的主要異質細胞群[15]。免疫應答反應中CD8+是抑制性T細胞，抑制免疫應答，CD4+是輔助性T細胞，而CD3+則為成熟T細胞[16]。因此，檢測腎癌患者外周血T細胞亞群的變化和體內細胞因子含量的變化對了解機體的免疫功能狀況具有重要作用。

1 資料與方法

1.1資料 術后隨訪我院2016年9月到2018年9月確診的60例腎癌患者，年齡32～78歲，平均年齡(49.3±7.5)歲，男34例，女26例。其中開放手術30例，腹腔鏡手術30例；腎癌根治性切除手術42例，保留腎單位手術18例。按照國際抗癌聯盟(UICC)對腫瘤的TNM分期標準，60例患者中T1N0M0期患者38例，T2N0M0期患者22例；左側腎癌28例，右側腎癌31例，雙側腎癌1例。對其進行DC-CIK細胞免疫治療前，對患者的腹部B超、胸部和腹部CT、肝功和腎功檢測、血常規和尿常規、外周血淋巴細胞亞群以及外周血相關細胞因子等情況進行評估。在患者身體確定無任何異常后，進行DC-CIK細胞免疫治療。DC-CIK細胞免疫治療經醫院倫理委員會批準，且患者本人知情同意。

1.2方法

1.2.1采血 對參加免疫療法的患者進行造血動員，堅持服用GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，沙格司亭)75 g，2次/d。實時監測外周血白細胞情況，當淋巴細胞和單核細胞數量之和達到2×109/L時采血，采血量約100 ml。

1.2.2DC誘導培養 Ficoll法分離外周血單個核細胞(PBMC)，RPMI1640培養基中2×106個/ml重懸。37℃孵育90 min，加入10%的AB血清(100 ng/ml rhGM-CSF和50 ng/ml rhIL-4)并洗去未貼壁細胞。繼續培養3 d后，換掉1/3的細胞培養液，及時補充細胞因子。第5天，用10%的AB血清重懸RPMI1640培養基，細胞濃度調整為1×106個/ml，按照DC與抗原濃度比例3∶1 加入腫瘤細胞抗原，共培養24 h，加入細胞因子IL-1β、IL-6、PGE-2和TNF-α，終濃度分別為10 ng/ml、20 ng/ml、0.5 ng/ml、10 ng/ml。誘導24 h。將成熟的DC細胞重懸到2 ml生理鹽水中，4℃保存用于后續注射。

1.2.3DC細胞注射 在腹股溝大腿內側兩側注射1 ml DC細胞懸液，每周1次，連續注射兩周。每次注射完成后，觀察45 min，無任何異常后方能離開。

1.2.4CIK細胞誘導培養 將外周血中沒有貼壁生長的單個核細胞收集后，用10%AB血清重懸到RPMI1640培養基中，細胞濃度為2.5×106個/ml。鋪到含有anti-CD3mAb和IFN-γ(1 000 U/ml)的培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育。第2天，添加生長因子IL-1α(10 ng/ml)和IL-2(250 U/ml)繼續培養。第3天，實時添加RPMI1640培養液并觀察細胞狀態。

1.2.5CIK回輸方案 每次CIK回輸前24 h，檢測CIK細胞，確定無污染后，將CIK細胞培養7～11 d，離心收集細胞。生理鹽水洗滌3次后，用含有患者10%血漿的生理鹽水重懸細胞，總體積約100 ml，2 h內通過靜脈滴注的方式將其回輸給患者，確保每次回輸細胞數約(5.0±0.5)×108個，每個患者共滴注5次。

1.2.6相關指標評估 ①相關免疫功能指標檢測：在治療前一周和治療后兩周，采取患者外周血，用流式細胞儀法和酶聯免疫吸附法(ELISA法)分別檢測患者T淋巴細胞亞群和相關細胞因子的含量。②肝功和腎功指標檢測：分別于治療前和治療后檢測患者肝功和腎功常規指標的變化。③生活質量評估：按照Kamofsky評分標準評估患者治療前和治療后的生活質量情況，評分標準為：100分，正常，無癥狀；90分，基本正常，有輕微癥狀；80分，勉強正常，有一些癥狀；70分，生活勉強自理，但是已經無法維持正常生活；60分，生活大部分還可以自理，但是偶爾需要別人幫助；50分，生活大部分都需要別人照顧；40分，生活不能自理，需要別人的照顧和幫助；30分，生活已經嚴重不能自理；20分，病重，需要住院治療；10分，病危，接近死亡；0分，死亡。④毒副反應觀察：治療期間密切觀察患者是否出現不良反應，包括發熱、嘔吐、皮疹等。

2 結果

2.1外周血中T淋巴細胞亞群百分比 取患者治療前一周和治療后兩周外周血，測定外周血中T淋巴細胞亞群的百分比，結果如表1所示，CD3+、CD4+T淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值增高，CD8+T淋巴細胞百分比下降。

2.2外周血中細胞因子含量 取患者治療前一周和治療后兩周外周血，測定外周血中細胞因子含量變化，結果如表2所示，細胞因子IL-2和IFN-γ的含量增加，IL-10的含量減少。

2.3患者生活質量評估 治療前，患者Kampfsky評分為(77.63±11.32)分，治療后患者Kampfsky評分為(85.28±12.57)分，差異具有統計學意義(P<0.05)，治療后患者的生活質量提高。

2.4患者不良反應 治療過程中，大部分患者無任何不良反應。7例患者出現低熱，且都在4 h內自動退熱，無高熱患者出現。2例患者出現輕微肌肉酸痛，都在耐受范圍內，未作特殊處理。1例患者出現血壓升高，處理后恢復正常。沒有嘔吐、肺水腫等情況。

3 討論

隨著醫學的發展，越來越多的腎癌患者在早期診斷時就可以發現，但還有20%～30%的患者在早期診斷時就已發生轉移，甚至還有相當一部分患者在手術治療后出現轉移[17]。全球每年新增20萬左右腎癌患者，病死率為50%～60%[18]。

LymphocyteBefore treatmentAfter treatmentP valueCD3+60.2±1.5567.4±0.890.019CD4+26.1±1.2837.6±0.540.026 CD8+25.3±1.7321.6±0.960.031CD4+/CD8+1.04±0.251.74±0.480.012

CytokineBefore treatmentAfter treatmentP valueIL-213.24±1.5118.42±0.890.005 9IFN-γ6.73±1.3512.36±1.590.008 2 IL-1015.46±1.3812.74±1.450.009 1

腎癌的治療主要以外科手術為主，同時，根據進展期腎癌的具體臨床特點，再加以細胞因子療法、放療、化療、分子靶向治療、生物免疫治療等相應的的輔助治療[19]。這些方式雖然能夠提高患者的存活率，但是副作用大，且復發性強。

DC是指一類具有典型樹突狀形態，能夠移行至淋巴器官并刺激初始型T細胞增殖活化，具有相對特異性表面物質的一類細胞，也是目前體內抗原遞呈能力最強的抗原遞呈細胞[20]。DC能夠分泌多種細胞因子，如IFN-α等，能夠誘導CTL，直接或間接影響B淋巴細胞增殖。研究發現DC可能通過以下途徑發揮抗腫瘤作用：①吞噬凋亡或壞死細胞；②被活化后的DC，能夠表達TNF家族的細胞因子；③直接抑制腫瘤細胞增殖；④增強NK和巨噬細胞殺傷腫瘤細胞的功能[21]。

CIK細胞是由多種細胞因子誘導產生的非特異性殺傷細胞，能夠產生大量的細胞因子(如IL-4、IFN等)，從而抑制或殺傷腫瘤細胞[22]。CIK細胞還可以促使Fas基因及Fas基因的配體合成[23]。正常情況下，CIK細胞對正常骨髓的細胞毒性小，在機體免疫系統和功能不受到損傷的前提下，CIK細胞還可以直接殺傷腫瘤[24]。

DC和CIK細胞聯合培養所產生的細胞群體比單獨CIK細胞具有更強的增殖活性，可同時提高DC及CIK細胞的功能[25]。近年來，DC-CIK細胞免疫治療法應用增多，具有安全、副作用小等優點[26]。

本研究中，患者在輸入DC和CIK細胞之前，先采集一份外周血中的單核細胞和淋巴細胞，加入相應的活性因子，分別單獨培養擴增，當細胞數量達到相應的數量級后，回輸到患者體內；整個治療期間，DC共注射2次，每周一次，CIK細胞共滴注5次，每隔一天滴注一次；這種輸注方式等同于建立了一定量的DC和CIK共培養體系，提高了細胞毒效應，使得機體的先天和后天免疫反應均被啟動，提高了殺傷性和特異性，對于腫瘤的轉移及復發起到了延緩或阻止作用。因此，本研究中將DC與CIK細胞聯合培養應用于腎癌的輔助治療，發揮協同抗腫瘤作用。本研究結果顯示，腎癌患者接受DC-CIK聯合細胞療法后，CD3+、CD4+T細胞增加(P<0.05)，CD8+T細胞減少(P<0.05)，同時相關的細胞因子IL-2、IFN-γ含量增加(P<0.01)，證明DC-CIK細胞免疫療法能更好地激發機體的免疫應答反應，提高患者免疫力，改善患者生存質量。這種生物免疫療法毒性低、治療效果好，是未來抗腫瘤治療的重要發展方向。

但是，本研究仍然面臨很多問題。第一，所有患者都采用同一套實驗方法，對于特殊患者來說，有效率可能大大降低。在將來的研究中，應該思考如何根據患者的腫瘤細胞特征，確定個體化免疫治療方案。第二，對患者生存質量評估，主要是實地觀察，患者及患者家屬的訪談，帶有一定不確定性，具有誤差。在將來的研究中，應該設計更為縝密的實驗方案，降低誤差。