右美托咪定通過p38通路改善發(fā)育期大鼠七氟醚麻醉后認(rèn)知功能障礙①

康文越 邢丹丹 付 強(qiáng) 丁 容 王志華 林 慧 (海南省人民醫(yī)院麻醉科，海口 570300)

大量研究已證實(shí)麻醉藥物是誘導(dǎo)術(shù)后認(rèn)知功能障礙的重要因素，有研究發(fā)現(xiàn)七氟醚可通過促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致老年患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙[1，2]。七氟醚作為嬰幼兒最常用的吸入麻醉藥，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)七氟醚可誘發(fā)新生鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡和認(rèn)知功能障礙[3]。右美托咪定為高選擇性α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，為常用的麻醉輔助藥物，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抑制交感神經(jīng)活動(dòng)、抗焦慮等效應(yīng)，可通過抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡抑制七氟醚引起的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4]。但右美托咪定減輕七氟醚對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。鑒于右美托咪定可通過p38信號(hào)通路等多種信號(hào)通路發(fā)揮作用[5]，本文探討右美托咪定是否通過p38信號(hào)通路改善發(fā)育期大鼠七氟醚麻醉后認(rèn)知功能障礙，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 健康、清潔級(jí)、7日齡、體重15～20 g、雌雄各半SD大鼠90只(北京華阜康生物科技股份有限公司、動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2014-000)。

1.1.2試劑 七氟醚(日本制藥株式會(huì)社，生產(chǎn)批號(hào)：40181)，右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：12011634)，生物素化抗地高辛抗體、二氨基聯(lián)苯胺、蘇木素-伊紅、SABC-FITC免疫熒光試劑盒、SABC免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒等(美國Invitrogen公司)，熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體、兔抗大鼠p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)多克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)多克隆抗體、兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)多克隆抗體、羊抗兔多克隆二抗等抗體(美國SANTA CRUZ公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組和處理 將90只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、七氟醚組(S組)、七氟醚+右美托咪定組(S+D組)，每組30只。C組大鼠腹腔注射0.9%生理鹽水10 μl，放入混合氣(氮?dú)狻醚鯕?7∶3)的密閉箱中；S組大鼠腹腔注射0.9%生理鹽水10 μl，放入體積分?jǐn)?shù)為0.68的氮?dú)狻Ⅲw積分?jǐn)?shù)為0.30的氧氣、體積分?jǐn)?shù)為0.02的七氟醚的混合氣的密閉箱中；S+D組大鼠腹腔注射右美托咪定10 μl(25 μg/kg右美托咪定用生理鹽水稀釋至10 μl)，放入體積分?jǐn)?shù)為0.68的氮?dú)狻Ⅲw積分?jǐn)?shù)為0.30的氧氣、體積分?jǐn)?shù)為0.02的七氟醚的混合氣的密閉箱中。混合氣體流量為2 L/min，持續(xù)吸入4 h。

1.2.2標(biāo)本采集 麻醉結(jié)束后4 h每組取出10只大鼠麻醉處死，取出海馬組織，放入多聚甲醛(4%)中固定，常規(guī)石蠟包埋，切成厚4 μm切片，用于TUNEL染色、免疫熒光染色和免疫組化染色；每組再取出10只大鼠麻醉處死，取出海馬組織用于Western blot測(cè)定；每組剩余的10只大鼠于麻醉后3周進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.2.3TUNEL染色測(cè)定大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù) 取大鼠海馬組織切片加入過氧化氫反應(yīng)10 min，蒸餾水沖洗，加入Tris緩沖液稀釋的蛋白酶(1∶200)消化10 min，加標(biāo)記液孵育2 h，Tris緩沖液沖洗，加入封閉液反應(yīng)30 min，加入生物素化抗地高辛抗體反應(yīng)30 min，加入生物素化過氧化物酶復(fù)合物反應(yīng)30 min，Tris緩沖液沖洗，DAB顯色，蘇木素-伊紅復(fù)染，Tris緩沖液沖洗，脫水、透明和封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞核含棕褐色顆粒為凋亡細(xì)胞，采用Meta Morph分析系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)高倍視野凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.4免疫熒光染色測(cè)定大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá) 取大鼠海馬組織冰凍切片，放入多聚甲醛(4%)中固定，加入兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體、兔抗鼠Bax多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體(1∶200)過夜孵育，加入熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體孵育5 min，加入羊抗兔多克隆抗體二抗孵育30 min，加入緩沖甘油，采用激光掃描共聚焦顯微鏡掃面熒光標(biāo)記陽性反應(yīng)物，發(fā)綠色熒光為陽性反應(yīng)物，測(cè)定每個(gè)高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度。

1.2.5免疫組化染色測(cè)定大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK表達(dá) 取大鼠海馬組織切片經(jīng)烤片、脫蠟、復(fù)水，加入內(nèi)源性過氧化物酶孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入枸櫞酸鈉緩沖液加熱孵育15 min，胰蛋白酶消化30 min，加入BSA孵育20 min封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)，加入兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗體(1∶100)過夜孵育，加入生物素標(biāo)記二抗孵育1 h，加入辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素孵育30 min，加入DAB顯色劑孵育10 min顯色，加入蘇木素染色4 min，經(jīng)脫水、透明、封片，光鏡下觀察細(xì)胞染色情況，細(xì)胞核周圍出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性表達(dá)，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度為：0級(jí)為陰性，1級(jí)為弱陽性，2級(jí)為陽性，3級(jí)為強(qiáng)陽性；陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)分級(jí)為：0%～1%為0級(jí)，2%～10%為1級(jí)，11%～50%為2級(jí)，51%～80%為3級(jí)，81%～100%為4級(jí)。免疫組化IHS評(píng)分為陽性細(xì)胞顯色評(píng)分×陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)評(píng)分，總分為0～12分。

1.2.6Western blot測(cè)定海馬CA1區(qū)p38MAPK、p-p38MAPK蛋白水平 取250 mg海馬組織加入1 ml RIPA在冰上勻漿，12 000 r/min離心10 min，提取總蛋白，測(cè)定總蛋白濃度，經(jīng)電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜，加入BSA封閉1 h，加入一抗(兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗體、兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗體，1∶1 000)，以β-actin為內(nèi)參(1∶2 000)過夜孵育，加入過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗孵育2 h，加入ECL顯影，放入機(jī)器曝光，采用NIH1162軟件分析蛋白條帶光密度值，p38MAPK、p-p38MAPK蛋白水平用p38MAPK、p-p38MAPK蛋白條帶光密度值/β-actin光密度值表示。

1.2.7Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定認(rèn)知功能 麻醉后3周，取每組剩下的10只大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。前4 d進(jìn)行定位航行試驗(yàn)：將高55 cm、直徑94 cm圓形水池注入水，水深40 cm，將水池分為4個(gè)象限，將平臺(tái)放在第3象限，平臺(tái)頂部距離水面3 cm，將大鼠每天上午10點(diǎn)和下午5點(diǎn)分別從4個(gè)象限中點(diǎn)放入水池，記錄大鼠逃避潛伏期(即達(dá)到平臺(tái)的時(shí)間)。第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)：將水池中的平臺(tái)撤去，觀察大鼠90 s時(shí)間內(nèi)穿越原平臺(tái)次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)比較 與C組比較，S組和S+D組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05)；與S組比較，S+D組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)，見表1和圖1。

2.2大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)情況比較 與C組比較，S組和S+D組大鼠海馬Cas-pase-3、Bax陽性細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度升高(P<0.05)，Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度降低(P<0.05)；與S組比較，S+D組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3、Bax陽性細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度降低(P<0.05)，Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度升高(P<0.05)，見表2和圖2。

2.3大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK免疫組化染色比較 與C組比較，S組和S+D組大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK免疫組化IHS評(píng)分升高(P<0.05)；與S組比較，S+D組大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK免疫組化IHS評(píng)分降低(P<0.05)，見表3和圖3。

2.4大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK、p-p38MAPK蛋白水平比較 3組大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，三組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中與C組比較，S組和S+D組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK蛋白水平升高(P<0.05)；與S組比較，S+D組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK蛋白水平降低(P<0.05)，見表4和圖4。

2.5大鼠水迷宮結(jié)果比較 與C組比較，S組和S+D 組大鼠逃避潛伏期延長(P<0.05)，穿越原平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05)；與S組比較，S+D組大鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)，穿越原平臺(tái)次數(shù)增加(P<0.05)，見表5。

GroupsnApoptotic cells(cells/mm2)Group C1016.47±3.24Group S1047.58±3.511)Group S+D1027.13±3.621)2)F208.739P0.000

Note:Compared with group C,1)P<0.05；compared with group S,2)P<0.05.

GroupsnCaspase-3Number of positivecells(cells)The fluorescenceintensityBaxNumber of positivecells(cells)The fluorescenceintensityBcl-2Number of positivecells(cells)The fluorescenceintensityGroup C107.21±2.176.57±1.975.52±2.125.13±1.7553.24±2.5141.26±2.42Group S1068.46±3.611)61.12±2.311)73.14±3.081)56.36±2.431)6.37±1.891)5.37±2.121)Group S+D1033.26±3.131)2)27.58±2.421)2)37.68±2.671)2)25.47±2.261)2)22.15±2.311)2)19.08±2.321)2)F1 029.3461 506.6461 625.8261 418.2671 121.885625.432P0.0000.0000.0000.0000.0000.000

Note:Compared with group C,1)P<0.05;compared with group S,2)P<0.05.

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞TUNEL染色(×400)Fig.1 TUNEL staining of apoptotic cells in hippocampal CA1 region of rats (×400)

圖2 大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3、Bax、Bcl-2免疫熒光染色(×400)Fig.2 Immunofluorescence staining of Caspase-3,Bax and Bcl-2 in hippocampal CA1 region of rats (×400)

Groupsnp38MAPK IHS scores(score) Group C100.57±0.42Group S103.15±0.571)Group S+D101.46±0.531)2)F65.869P0.000

Note:Compared with group C,1)P<0.05；compared with group S,2)P<0.05.

圖3 大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK免疫組化染色(×400)Fig.3 Immunohistochemical staining of p38MAPK in hippocampal CA1 region of rats (×400)

Groupsnp38MAPK proteinp-p38MAPK proteinGroup C100.24±0.080.11±0.04Group S100.22±0.110.92±0.131)Group S+D100.29±0.100.65±0.111)2)F1.368166.765P0.2720.000

Note:Compared with group C,1)P<0.05；compared with group S,2)P<0.05.

圖4 大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK、p-p38MAPK蛋白Western blot電泳圖Fig.4 Western blot analysis of p38MAPK and p-p38MAPK proteins in hippocampal CA1 region of rats

GroupsnEscape latency(s)1 d2 d3 d4 dNumber of crossing theoriginal platform(times)Group C1026.41±3.5215.46±3.3812.16±2.289.42±2.358.79±1.74Group S1042.25±3.411)33.57±3.521)28.72±2.311)25.47±2.461)4.35±1.581)Group S+D1034.17±3.261)2)22.15±3.371)2)19.03±2.161)2)15.71±2.171)2)6.21±1.641)2)F54.32271.527136.620120.50118.159P0.0000.0000.0000.0000.000

Note:Compared with group C,1)P<0.05；compared with group S,2)P<0.05.

3 討論

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡為主動(dòng)過程，為由基因控制的細(xì)胞有序凋亡，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中具有重要作用。細(xì)胞凋亡是多種基因參與的一種生理過程，如Caspase家族、Bcl-2家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等基因均參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，這些基因在種屬之間比較保守[6]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡受多種信號(hào)通路調(diào)控，MAPK信號(hào)通路為參與細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路，p38MAPK為MAPK家族成員之一，p38MAPK可能為Caspase家族上游發(fā)揮抗凋亡的作用，Caspase可通過激活p38MAPK上游蛋白激酶誘導(dǎo)p38MAPK磷酸化，p38MAPK活化可通過磷酸化P53、誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位等多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7，8]。Caspase-3、Bax、Bcl-2在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，Caspase-3為凋亡過程中的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮最關(guān)鍵作用；Bax、Bcl-2為Bcl-2家族成員，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮相互對(duì)立的作用，Bcl-2為凋亡抑制基因，Bax可拮抗Bcl-2的作用，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用；Caspase-3、Bax、Bcl-2三者相互作用，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生[9，10]。

七氟醚為臨床常用的麻醉藥之一[11]，具有接受性好、不刺激呼吸道、誘導(dǎo)快等優(yōu)點(diǎn)，是嬰幼兒麻醉中最常用的吸入麻醉藥，近年來研究發(fā)現(xiàn)七氟醚對(duì)神經(jīng)元具有損傷作用，可引起認(rèn)知功能障礙[12]；七氟醚可通過抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體功能發(fā)揮麻醉作用，可通過抑制海馬CA1區(qū)突觸長時(shí)程增強(qiáng)表達(dá)而影響認(rèn)知功能[13]。七氟醚引起神經(jīng)損傷和認(rèn)知功能障礙的機(jī)制比較復(fù)雜：可通過影響新生大鼠海馬結(jié)構(gòu)中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響新生大鼠的認(rèn)知功能[14]；可通過p38MAPK信號(hào)通路引起新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

右美托咪定為α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有高選擇性，α2腎上腺素受體在外周神經(jīng)細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛存在，主要分布在海馬旁回、藍(lán)斑、扣帶回等區(qū)域，其中海馬是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)，學(xué)習(xí)記憶功能和海馬神經(jīng)的發(fā)生關(guān)系密切[16]。右美托咪定作為麻醉輔助藥物，具有催眠、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用，對(duì)呼吸無抑制作用，具有神經(jīng)保護(hù)作用，可通過減輕七氟醚誘導(dǎo)的海馬細(xì)胞周期阻滯等途徑治療七氟醚引起的神經(jīng)損傷和認(rèn)知功能障礙[17，18]。右美托咪定可通過p38等信號(hào)通路發(fā)揮作用，如右美托咪定通過抑制p38MAPK/TXNIP信號(hào)傳導(dǎo)活化治療腎缺血和再灌注損傷[19]；右美托咪定通過p38MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑保護(hù)大鼠免受氧-葡萄糖剝奪/再氧合損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。

鑒于七氟醚可通過p38等多種途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，右美托咪定可減輕七氟醚引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和認(rèn)知功能障礙，且可通過p38信號(hào)通路途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，因此本文探討右美托咪定是否通過p38通路改善發(fā)育期大鼠七氟醚麻醉后認(rèn)知功能障礙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)七氟醚可引起發(fā)育期大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)升高；Caspase-3、Bax、p38MAPK表達(dá)量增加，Bcl-2表達(dá)降低，逃避潛伏期延長，穿越原平臺(tái)次數(shù)減少；而右美托咪定可使七氟醚作用的發(fā)育期大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)降低，Caspase-3、Bax、p38MAPK表達(dá)量下降，Bcl-2表達(dá)升高，逃避潛伏期縮短，穿越原平臺(tái)次數(shù)增加。Caspase-3、Bax、Bcl-2和細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，Caspase-3、Bax表達(dá)量升高，Bcl-2表達(dá)量下降表明海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡增加。

綜上所述，七氟醚可通過p38信號(hào)通路途徑誘導(dǎo)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，引起神經(jīng)功能障礙；右美托咪定可通過抑制p38信號(hào)通路途徑抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡，從而改善認(rèn)知神經(jīng)功能障礙。