卡他莫拉菌經NADPH氧化酶/ROS/TGF-α信號通路誘導支氣管上皮細胞表達MUC5AC①

申文娟 張 凱 肖 宏 曾鈞發

(南華大學附屬第二醫院重癥醫學科，衡陽 421001)

卡他莫拉菌是一種人類特有的呼吸道條件致病菌，主要引起兒童上頜竇炎、中耳炎及肺炎，是僅次于流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌的成人慢性下呼吸道感染常見致病菌[1,2]。近年來，卡他莫拉菌感染的發病率呈逐年遞增趨勢，尤其多見于慢性阻塞性肺病患者[3]。盡管環境因素和宿主因素均能影響卡他莫拉氏菌感染的發生發展，但卡他莫拉菌引起致病的毒力因子及具體的致病機制尚未可知?？紤]到卡他莫拉菌的致病機制復雜多樣且易產生耐藥菌株，明確其致病作用的分子機制對于有效預防控制卡他莫拉菌感染十分關鍵。

黏液分泌是機體一種重要的先天防御機制，黏蛋白是黏液分泌物的主要成分，是由黏膜上皮細胞合成的高分子量、高糖基化蛋白，具有保護黏膜表面、捕獲吸入的微生物顆粒等作用[4]。MUC5AC是機體重要的膠樣黏蛋白，其表達水平直接反映呼吸道炎癥疾病的進展情況[5]，與黏液分泌性疾病的病理病變有關，如在支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病以及支氣管擴張等患者體內，呼吸道黏膜MUC5AC水平均顯著增高[6]。卡他莫拉菌感染可促進患者呼吸道上皮細胞中MUC5AC的分泌[7]。盡管已有研究證實了MUC5AC在卡他莫拉氏菌感染致病過程中的重要作用，但其具體作用機制仍不明確。因此，本研究通過探究卡他莫拉菌誘導支氣管上皮細胞表達MUC5AC的分子機制，旨在為有效預防控制卡他莫拉菌感染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 卡他莫拉菌(ATCC-25238)購自美國ATCC公司；人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B購自中科院細胞庫；人MUC5AC檢測試劑盒購自武漢優爾生科技股份有限公司；RNA提取試劑盒購自Thermo Fisher公司；細胞胞質蛋白提取試劑盒、細胞膜蛋白提取試劑盒購自上海聯邁生物工程有限公司；ROS抑制劑NAC、NADPH氧化酶抑制劑Apocynin、鼠抗p47phox抗體、DCFH-DA試劑購自Sigma公司；人TGF-α ELISA試劑盒購自Invitrogen公司；TGF-α中和抗體購自上海玉博生物科技有限公司；DMEM培養基等細胞培養試劑購自上海生物工程股份有限公司。

1.1.2研究對象 正常對照組26例，無各類感染性疾病、各類慢性疾病及惡性腫瘤疾病。2016年1月至2019年2月本院收治的卡他莫拉菌感染患者34例作為研究對象，本研究經南華大學醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1細胞培養與處理 BEAS-2B細胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養基(含1%的青霉素-鏈霉素混合液)，并于37℃、5%CO2條件下培養。待細胞生長至對數期，細胞生長密度為80%～90%時進行如下處理：①加入MOI為0.001、0.01、0.1的卡他莫拉菌分別感染細胞8、16、24、32、38 h。②分別在感染前用10 mmol/L ROS抑制劑NAC以及1 mmol/L NADPH氧化酶抑制劑Apocynin預處理細胞。③卡他莫拉菌感染細胞后用TGF-α中和抗體處理。

1.2.2ELISA檢測MUC5AC及TGF-α含量 收集1.2.1中不同處理后的細胞上清，依據人MUC5AC、TGF-α ELISA Kit說明書操作步驟檢測細胞上清中MUC5AC及TNF-α含量，并在酶標儀450 nm 處測定各組樣本的OD值。每次實驗重復3次。最后通過標準品檢測繪制的標準曲線計算各細胞上清中MUC5AC及TNF-α的濃度。

1.2.3qPCR檢測MUC5AC mRNA水平 收集1.2.1中處理的細胞，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，純化后逆轉錄為cDNA，隨后采用30 μl的qPCR反應體系進行引物擴增，引物設計見表1。擴增完畢后，使用2-ΔΔCt法計算MUC5AC mRNA的相對表達量。

1.2.4DCFH-DA法檢測細胞內ROS含量 收集1.2.1中處理完成的細胞，用無菌PBS洗2遍后，加入5 μmol/L DCFH-DA于37℃培養箱中避光反應30 min。DCFH-DA孵育結束后，再用無菌的PBS清洗2遍。最后設置熒光酶標儀條件為激發波長485 nm，發射波長530 nm檢測熒光強度。按照說明書計算熒光相對值，熒光相對值越大提示ROS含量越高。

表1 MUC5AC and GAPDH引物列表

Tab.1 Primers for MUC5AC and GAPDH

GeneForwardReverseMUC5AC5′-CCATAGTACAGTGGTCGATGC-3′5′-GATCGATACATGGGTAGACTT-3′GAPDH5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′

1.2.5Western blot檢測NADPH氧化酶p47phox表達 收集1.2.1中處理后的細胞，依據細胞胞質蛋白提取試劑盒及細胞膜蛋白提取試劑盒說明書分別提取細胞胞質蛋白與胞膜蛋白。取15 μl蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，并于轉膜儀中進行轉膜。轉膜完成后于5%脫脂奶粉中封閉過夜，分別用稀釋后的一抗和二抗進行孵育。最后于顯影儀中進行ECL發光顯影。

1.2.6血清TGF-α與支氣管肺泡灌洗液中MUC5AC測定 血清中TGF-α濃度的測定根據ELISA試劑盒說明書進行，肺泡灌洗液的獲取根據纖維支氣管鏡操作規范進行?；颊呓浘植柯樽砗?，將電子支氣管鏡經患者一側鼻腔伸入至下呼吸道分泌物較多的部位，給予50 ml 無菌生理鹽水進行灌洗或待刷檢后反復灌洗，收集灌洗液，采用ELISA法測定灌洗液中MUC5AC濃度。采用ELISA測定血清中TGF-α以及灌洗液中MUC5AC的濃度。

2 結果

2.1卡他莫拉菌誘導支氣管上皮細胞分泌MUC5AC 分別采用MOI為0.001、0.01和0.1的卡他莫拉菌感染BEAS-2B細胞16 h后，檢測細胞內MUC5AC表達水平。ELISA結果顯示，隨著MOI遞增，MUC5AC含量明顯增多(P<0.05，圖1A)。qPCR結果顯示，不同MOI處理細胞8 h后，MUC5AC mRNA表達呈濃度依賴性上升(圖1B)。

2.2卡他莫拉菌誘導MUC5AC分泌依賴于ROS 檢測卡他莫拉菌感染細胞內ROS的表達水平，結果如圖2A所示，0.1 MOI卡他莫拉菌處理可顯著提高細胞內ROS的表達水平。而采用5、10 mmol/L ROS抑制劑NAC預處理細胞后，細胞內MUC5AC的分泌水平顯著降低(P<0.05,圖2B)。

圖1 BEAS-2B細胞中MUC5AC表達水平Fig.1 Expression level of MUC5AC in BEAS-2B cellsNote: A.ELISA was used to detect the level of MUC5AC in BEAS-2B cells;B.qPCR was used to detect relative expression of MUC5AC mRNA,*.P<0.05.

2.3NADPH氧化酶參與MUC5AC分泌 Western blot結果顯示(圖3A)，卡他莫拉菌感染可明顯減少細胞質內NADPH氧化酶p47phox的表達，而增加細胞膜上p47phox的表達，提示卡他莫拉菌感染可使NADPH氧化酶p47phox從細胞漿轉移至細胞膜。采用0.5、1 mmol/L NADPH氧化酶抑制劑Apocynin預處理感染的細胞，結果顯示細胞中ROS水平明顯降低(圖3B)，同時伴有MUC5AC的減少(圖3C)。此外，采用Western blot檢測MUC5AC的表達水平，結果與ELISA檢測結果相符(圖3D)。

圖2 BEAS-2B細胞中ROS表達水平Fig.2 Expression level of ROS in BEAS-2B cellsNote: A.Immunofluorescence was used to detect ROS expression in BEAS-2B cells;B.Level of MUC5AC was detected by ELISA,*.P<0.05.

圖3 NADPH氧化酶對卡他莫拉菌誘導BEAS-2B細胞分泌MUC5AC的影響Fig.3 Effect of NADPH oxidase on secretion of MUC5AC in BEAS-2B cell induced by Moraxella catarrhalisNote: A.NADPH oxidase were detected by Western blot from cytoplasma proteins (CE) or cell membrane (CE),G protein subunit (Gas) was used as internal control of membrane;B.Immunofluorescence was used to detect ROS level;C.Level of MUC5AC was detected by ELISA, *.P<0.05;D.Western blot detected MUC5AC expression.

圖4 TGF-α對卡他莫拉菌誘導BEAS-2B細胞分泌MUC5AC的影響Fig.4 Effect of TGF-α on secretion of MUC5AC in BEAS-2B cell induced by Moraxella catarrhalisNote: A.ELISA was used to detect level of TGF-α in BEAS-2B cells;B.Level of MUC5AC was detected by ELISA,*.P<0.05.

圖5 卡他莫拉菌感染對TGF-α和MUC5AC分泌的影響Fig.5 Effects of Moraxella catarrhalis infection on secretion of TGF-α and MUC5ACNote: A.ELISA was used to detect level of TGF-α in infected-serum;B.Level of MUC5AC in airway lavage fluid was detected by ELISA,*.P<0.05.

2.4卡他莫拉菌誘導BEAS-2B細胞分泌MUC5AC與TGF-α有關 檢測感染細胞內TGF-α的分泌情況，結果如圖4A所示，不同濃度卡他莫拉菌感染BEAS-2B細胞16 h后，可顯著誘導其分泌TGF-α。而采用10 mmol/L ROS抑制劑NAC或NADPH氧化酶抑制劑Apocynin 1 mmol/L處理則能夠明顯降低TGF-α分泌水平。此外，采用TGF-α中和抗體處理感染了卡他莫拉菌的細胞，細胞內MUC5AC分泌水平顯著降低(圖4B)。

2.5卡他莫拉菌感染上調TGF-α和MUC5AC分泌 觀察卡他莫拉菌感染患者血清中TGF-α及呼吸道灌洗液中MUC5AC的含量，結果顯示，正常對照組血清中TGF-α及氣道中MUC5AC水平較低。而感染組患者TGF-α和MUC5AC含量顯著增高，與體外研究結果類似(圖5)。

3 討論

卡他莫拉菌是一種革蘭氏陰性需氧球菌，是人體的正常寄生菌。近年研究發現卡他莫拉菌與許多呼吸道疾病有關，包括15%～20%的急性中耳炎感染、20%的兒童急性鼻竇炎以及10%的成人慢性阻塞性肺病等[8]?？ㄋ腥竞罂绅じ接诤粑辣砻?，并刺激黏膜細胞分泌IL-1β、IL-8、MUC5AC進而誘導炎癥的發生[7]。在本研究中，課題組發現卡他莫拉菌感染后氣道內MUC5AC水平顯著增高，然而，卡他莫拉菌感染誘導呼吸道黏膜分泌MUC5AC的作用機制目前尚不明確。

MUC5AC是一種高糖基化的分泌型黏蛋白，由于其富含半胱氨酸可形成復雜聚合物，進而黏附于上皮細胞表面[9]。研究表明，MUC5AC具有多種生物學功能，包括對上皮細胞屏障功能、宿主與病原體的相互作用、募集免疫細胞及促進腫瘤發展等[10,11]。而在不同呼吸道感染疾病中，MUC5AC過表達均可通過破壞支氣管與肺部結構引發炎癥反應[12]。因此，MUC5AC常被作為呼吸道感染炎癥損傷的重要標記物。本研究中，我們采用不同感染復數的卡他莫拉菌感染人支氣管上皮細胞后均能誘導其分泌MUC5AC，該結果與之前的研究基本相符。

ROS是由呼吸道上皮細胞產生的一種炎癥介質，與多種呼吸系統疾病的發病機制有關，如哮喘、肺氣腫和慢性阻塞性肺病等[13]。除已知的細胞毒性氧化應激外，越來越多的證據表明ROS在信號轉導中也發揮重要作用，其中就包括各種刺激(如吸煙、中性粒細胞彈性酶)引起的MUC5AC分泌[14]。而本研究中也發現，卡他莫拉菌處理可顯著提高細胞內ROS的表達水平，而ROS抑制劑則能夠明顯減少細胞內MUC5AC的分泌，提示卡他莫拉菌誘導的MUC5AC分泌依賴于ROS。

NADPH氧化酶是由細胞質膜和細胞胞漿成分組成的一個多酶復合體，主要參與ROS分泌的調控[15]。而p47phox是其位于胞漿中的主要成分之一，能夠通過轉移至胞膜促進NADPH氧化酶的合成[16]。通過Western blot檢測發現卡他莫拉菌感染可顯著降低細胞質內p47phox的表達而增加細胞膜上p47phox的表達，提示他莫拉菌感染可使p47phox發生轉位進而促進NADPH氧化酶合成。進一步用NADPH氧化酶抑制劑處理細胞，發現ROS以及MUC5AC水平均顯著降低，表明NADPH氧化酶也參與MUC5AC的分泌。

研究表明，TGF-α具有促進細胞增殖分化等生物活性，且與機體炎癥病變有關，是一種重要的炎癥調節因子。之前有報道顯示，假銅綠單胞菌LPS誘導的炎癥反應主要通過ROS釋放TGF-α進而上調MUC5AC表達[17]。本研究中，同樣在卡他莫拉菌感染的細胞中發現了較高水平的TGF-α。而ROS抑制劑及NADPH氧化酶抑制劑均能顯著抑制TGF-α的分泌。進一步采用TGF-α中和抗體處理細胞，發現細胞內MUC5AC分泌水平也顯著降低，與之前報道基本相符。

綜上所述，本研究初步證實卡他莫拉菌感染支氣管上皮細胞后能夠通過激活NADPH氧化酶/ROS/TGF-α信號通路促進MUC5AC表達，進而誘導炎癥反應。但由于參與調控MUC5AC表達的機制十分復雜，是否還存在其他調控機制目前尚不明確，有待進一步研究。