美托洛爾對大鼠心肌梗死后Th1平衡以及鉀通道Kv2.1和KIR2.1表達的調控①

黃 侃 史慧穎 王淑男 霍艷萍 劉燦君 那靜濤

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院心血管二科,齊齊哈爾 161000)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是導致心血管疾病患者死亡的重要原因，調查顯示近年來MI發病率和死亡率逐年升高[1]。MI常引發左心室重塑造成心室舒張、收縮功能受損，嚴重威脅患者生命健康[2]。近期研究發現鉀離子通道在心肌細胞電生理穩態中發揮重要調控作用，急性心肌缺血后，細胞外鉀離子濃度升高，細胞中鉀離子缺失或鈉內流，造成外向鉀離子電流減少，導致心肌細胞動作電位時程(action potential duration,APD)延長，引發心律失常等[3]。KIR2.1、Kv2.1分別為快速激活延遲整流鉀電流、緩慢激活延遲電流的主要形成蛋白，動物研究顯示MI發生后，KIR2.1、Kv2.1水平出現不同程度的降低，因此抑制鉀離子電流通道開放是治療MI的重要研究方向[4]。過往研究顯示急性MI與免疫應答有關，MI發生后，脾臟淋巴液輔助T細胞1(Th1)型炎癥因子水平升高，Th2型炎癥因子水平降低，Th1/Th2細胞免疫失衡[5]。體外研究發現，調控Th1/Th2平衡向Th1移動，可減弱鉀通道KIR2.1的表達[6]，然而在體內研究中尚未見報道。本研究通過制備MI大鼠模型，并給予美托洛爾(Metoprolol)干預，以期探究對MI大鼠心肌保護的作用，并初步探究其對MI大鼠免疫平衡以及鉀離子通道蛋白的影響，為臨床應用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠購自河南省實驗動物中心，體質量220～260 g，8周齡，合格證號：SYXK(豫)2016-0002。本研究經本院動物倫理委員會批準，嚴格按照《關于善待實驗動物的指導性意見》進行飼養，適性飼養1周后用于模型制備。

1.1.2試劑與儀器 美托洛爾片購自阿斯利康制藥有限公司，批號：170429；RPMI1640培養液購自美國Gibco公司，貨號：ZQ-211；蛋白裂解液、血清干擾素γ(IFN-γ)、IL-2、IL-4、IL-10檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所，貨號：P0013、PI508、PI575、PI5365、PI522；氯化三苯硝基四氮唑紅(Triphenylnitrotetrazolium chloride，TTC)溶液、IL-4(APC標記)、IFN-γ(DAPI標記)購自美國Sigma公司，貨號：42135、MABF150B、F8648；CD3抗體(FITC標記)、CD4抗體(PE標記)購自美國R&D公司，貨號：HTCC30、MCD8C-1005；鼠抗T盒子轉錄因子(T-box expressed in T cells，T-bet)、GATA結合蛋白3(GATA binding protein 3，GATA-3)、Kv2.1、KIR2.1、β-actin一抗購自英國Abcam公司，貨號：ab91109、ab113519、ab192761、ab85492、ab124964；HRP二抗購自美國CST公司，貨號：4134；SZ51倒置顯微鏡購自日本Olympus；GelDocEZ凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1MI大鼠模型制備 根據文獻[7]制備MI大鼠模型，腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉充分麻醉大鼠，左側第三肋間切開左胸，于左冠狀動脈前降支根部1～2 mm處用6-0無菌線進行結扎。當左心室顏色由紅色變為白色，心電圖檢測顯示ST段明顯抬高時，表示結扎成功[8]。結扎完成后迅速放回心臟，縫合切口，恢復大鼠自主呼吸。設置假手術組(Sham，n=12)僅栓線不進行冠動脈結扎，其余操作與MI組相同。術后每天注射10萬單位青霉素，預防感染，持續3 d。排除制備過程中死亡、未達標準的大鼠，MI造模成功大鼠共48只。

1.2.2動物分組與給藥 將48只MI造模成功的大鼠隨機分成4組，每組12只：模型組(MI)、美托洛爾低劑量組(L-metoprolol)、美托洛爾中劑量組(M-metoprolol)、美托洛爾高劑量組(H-metoprolol)。造模后第3天，對各組大鼠進行藥物干預。美托洛爾各組：灌胃美托洛爾片水溶液，參考文獻[9]，劑量分別選擇為4、8、16 mg/kg，1次/日，灌胃容積為10 ml/kg，連續給藥4周。Sham組和MI組均灌胃10 ml/kg生理鹽水，連續處理4周。

1.2.3超聲檢測大鼠左心室功能 末次給藥后，麻醉大鼠，取仰臥位，用彩色多普勒超聲檢測儀，調至二維模式，于左心室長軸切面檢測，主要檢測指標包括，左心室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD),至少連續檢測3個完整心動周期，求取平均值，計算左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室短軸縮短率(fractional shortening，FS)、心搏量(stroke volume,SV)。

1.2.4大鼠血液動力學檢測 末次給藥后所有大鼠麻醉后，切開頸部，迅速分離左股動脈及右頸動脈，將導管經右頸總動脈插進入左心室，對左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室內壓上長及下降最大速率(+dp/dtmax/-dp/dtmax)進行檢測。

1.2.5TTC染色評估大鼠梗死面積 末次給藥后，各組隨機選取6只大鼠，注射30 mg/kg戊巴比妥鈉充分麻醉大鼠，處死后獲取心臟，充分清洗后橫向切成5片，置于1%TTC染液中染色15 min，正常心肌染色為紫紅色，梗死區域呈淡白色，拍照，使用Image J軟件掃描分析梗塞區域體積，計算梗死面積百分比(%)=梗死區體積/總體積×100%。

1.2.6樣本采集 將各組剩余6只大鼠，麻醉后放血處死，采集血液1 ml，3 000 r/min離心5 min收集血清；獲取心肌組織，清洗后，將心肌組織剪碎，置于液氮中保存；獲取脾臟組織用于制備淋巴液及蛋白檢測。

1.2.7血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平檢測 采用酶聯免疫法檢測血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平，具體參照試劑盒說明書進行操作。

1.2.8流式細胞術檢測淋巴液Th1/Th2細胞比率 將脾臟組織清洗后剪碎加入淋巴細胞分離液，用200目尼龍網過濾，加入RPMI1640培養液后，4 000 r/min 離心30 min，吸取分離液中層淋巴細胞，加入緩沖液洗滌，收集淋巴細胞，用RPMI1640培養液重懸細胞，將細胞密度調至1×106個/ml。添加CD3抗體(FITC標記)、CD4抗體(PE標記)進行細胞標記，避光溫育15 min，添加固定劑室溫避光溫育15 min，添加生理鹽水清洗后加入破膜劑室溫下固定15 min，分別添加IL-4(APC標記)、IFN-γ(DAPI標記)抗體避光溫育25 min，離心后棄上清，置于流式細胞儀中檢測Th1、Th2細胞比例變化。

1.2.9蛋白免疫印跡法檢測T-bet、GATA-3、Kv2.1、KIR2.1蛋白表達 冷凍心肌組織、脾臟組織，研磨后加入蛋白裂解液，參照蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，測定蛋白后進行SDS-PAGE分離蛋白，半干轉印至PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉封閉；采用T-bet、GATA-3、Kv2.1、KIR2.1一抗(1∶500)4℃孵育過夜；采用HRP標記二抗(1∶5 000)孵育1 h。經化學發光后檢測，保存圖像后用Image J軟件定量分析蛋白相對表達量。

2 結果

2.1美托洛爾對心肌梗死大鼠心室功能的影響 與Sham組相比，MI組LVEDD、LVESD顯著升高，LVEF、SV、FS顯著降低(P<0.05)；與MI組相比，美托洛爾各組LVEDD、LVESD顯著降低，LVEF、SV、FS顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2美托洛爾對心肌梗死大鼠血流動力學的影響 與Sham組相比，MI組大鼠MAP、LVSP、+dp/dtmax降低，LVEDP、-dp/dtmax顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與MI組相比，美托洛爾各組大鼠MAP、LVSP、+dp/dtmax升高，LVEDP、dp/dtmax降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3美托洛爾對心肌梗死大鼠梗死面積的影響 與Sham組相比，MI組大鼠心肌梗死面積比例升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與MI組相比，美托洛爾各組大鼠心肌梗死面積比例降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表3。

GroupsLVEDD(mm)LVESD(mm)LVEF(%)SV(ml)FS(%)Sham5.49±0.413.21±0.3883.54±5.370.36±0.0546.06±4.64MI7.79±0.361)5.69±0.371)66.29±4.621)0.17±0.031)23.57±2.86L-metoprolol6.37±0.292)5.25±0.292)74.87±4.392)0.23±0.042)29.39±4.352)M-metoprolol5.87±0.372)4.73±0.262)79.16±4.672)0.26±0.062)33.58±3.492)H-metoprolol5.24±0.392)4.58±0.352)81.89±5.632)0.31±0.052)41.72±3.412)

Note:Compared with Sham group,in MI group,the LVEDD and LVESD increased significantly,while LVEF,SV and FS decreased significantly，1)P<0.05;compared with MI group,in metoprolol group，the LVEDD and LVESD decreased，2)P<0.05.

GroupsMAP(mmHg)LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(103 mmHg/s)-dp/dtmax(103 mmHg/s)Sham121.06±12.58135.24±13.85 6.81±0.873.89±0.29 -3.98±0.25 MI92.67±9.291)108.96±10.151)13.01±2.171)2.76±0.311)-2.65±0.241)L-metoprolol105.16±10.182)122.54±12.932)11.91±1.152)3.13±0.252)-2.94±0.282)M-metoprolol110.19±8.762)129.33±11.132)8.08±1.242)3.34±0.242)-3.28±0.272)H-metoprolol116.55±9.322)133.68±11.862)7.42±1.062)3.55±0.332)-3.54±0.342)

Note:Compared with Sham group,MAP,LVSP,+dp/dtmax decreased,LVEDP,-dp/dtmax increased，1)P<0.05;compared with MI group,in metoprolol group,MAP,LVSP,+dp/dtmax increased,LVEDP,-dp/dtmax decreased,2)P<0.05.

圖1 TTC染色評估各組大鼠心肌梗死面積 Fig.1 Myocardial infarct size by TTC staining in rats of different groupsNote: Compared with Sham group,in MI group,the volume ratio of myocardial infarction increased;compared with MI group,in metoprolol group，the volume ratio of myocardial infarction decreased.

GroupsMyocardial infarction size(%)Sham3.65±0.81MI39.82±3.681)L-metoprolol27.36±3.032)M-metoprolol22.42±3.222)H-metoprolol20.18±3.092)

Note:Compared with Sham group,in MI group,the volume ratio of myocardial infarction increased,1)P<0.05;compared with MI group,in metoprolol group，the volume ratio of myocardial infarction decreased,2)P<0.05.

GroupsIFN-γ(pg/ml)IL-2(pg/ml)IL-4(pg/ml)IL-10(pg/ml)Sham42.27±8.36 40.18±8.26 0.56±0.07 81.29±8.54 MI116.86±15.191)75.91±12.131)0.24±0.031)40.10±6.131)L-metoprolol83.93±14.212)65.87±13.192)0.33±0.052)55.65±7.342)M-metoprolol72.06±12.172)58.03±9.152)0.39±0.052)62.19±6.472)H-metoprolol63.12±10.232)51.53±10.192)0.45±0.062)70.12±7.522)

Note:Compared with Sham group,in MI group,the levels of serum IFN-γ and IL-2 increased,the levels of IL-4 and IL-10 decreased，1)P<0.05;compared with MI group,in metoprolol group，the levels of serum IFN-γ and IL-2 decreased,the levels of IL-4 and IL-10 increased,2)P<0.05.

2.4美托洛爾對心肌梗死大鼠Th1、Th2型細胞因子的影響 與Sham組相比，MI組大鼠血清IFN-γ、IL-2水平升高，IL-4、IL-10水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與MI組相比，美托洛爾各組血清IFN-γ、IL-2水平降低，IL-4、IL-10水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

2.5美托洛爾對心肌梗死大鼠Th1、Th2型細胞比率的影響 與Sham組相比，MI組Th1細胞比率升高，Th2細胞比率降低，Th1/Th2比值升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與MI組相比，美托洛爾各組Th1細胞比率降低，Th2細胞比率升高，Th1/Th2比值降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表5。

2.6美托洛爾對Th1/Th2細胞轉錄因子表達的影響 與Sham組相比，MI組脾臟、心肌組織中T-bet蛋白表達升高， GATA-3蛋白表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與MI組相比，美托洛爾各組脾臟、心肌組織中T-bet蛋白表達降低，GATA-3蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4、5，表6。

圖2 流式細胞術檢測淋巴液中Th1細胞比率Fig.2 Th1 cell ratio in lymph by flow cytometryNote: Compared with Sham group,in MI group,Th1 cell ratio increased;compared with MI group,in metoprolol group,Th1 cell ratio decreased.

圖3 流式細胞術檢測淋巴液中Th2細胞比率Fig.3 Th2 cell ratio in lymph by flow cytometryNote: Compared with Sham group,in MI group,Th2 cell ratio decreased;compared with MI group,in metoprolol group,Th2 cell ratio increased.

GroupsTh1(%)Th2(%)Th1/Th2Sham1.15±0.260.78±0.081.47±0.37MI4.86±0.291)0.13±0.021)37.38±8.481)L-metoprolol3.06±0.242)0.25±0.052)12.24±2.542)M-metoprolol2.53±0.212)0.35±0.042)7.23±1.412)H-metoprolol2.28±0.192)0.63±0.102)3.64±0.872)

Note:Compared with Sham group,in MI group,Th1 cell ratio increased,Th2 cell ratio decreased,1)P<0.05;compared with MI group,in metoprolol group,Th1 cell ratio decreased,Th2 cell ratio increased,2)P<0.05.

2.7美托洛爾對MI大鼠鉀通道Kv2.1和KIR2.1蛋白表達的影響 與Sham組相比，MI組心肌組織中Kv2.1、KIR2.1蛋白表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與MI組相比，美托洛爾各組Kv2.1、KIR2.1蛋白表達升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖6，表7。

圖4 免疫印跡法檢測心肌組織T-bet、Gata-3蛋白表達Fig.4 T-bet,Gata-3 protein expression in myocardial tissue by Western blotNote: 1.Sham group;2.MI group;3.L-metoprolol group;4.M-metoprolol group;5.H-metoprolol group.

圖5 免疫印跡法檢測脾臟組織T-bet、GATA-3蛋白表達Fig.5 T-bet,GATA-3 protein expression in spleen tissue by Western blotNote: 1.Sham group;2.MI group;3.L-metoprolol group;4.M-metoprolol group;5.H-metoprolol group.

GroupsSpleen tissueGATA-3/β-actinT-bet/β-actinMycardial tissueGATA-3/β-actinT-bet/β-actinSham1.34±0.180.37±0.040.87±0.130.22±0.03MI0.23±0.041)1.15±0.271)0.15±0.031)0.94±0.111)L-metoprolol0.35±0.062)0.87±0.082)0.25±0.042)0.75±0.092)M-metoprolol0.81±0.052)0.49±0.062)0.35±0.032)0.53±0.102)H-metoprolol1.02±0.082)0.27±0.042)0.57±0.062)0.42±0.052)

Note:Compared with Sham group,in MI group,the expression of T-bet protein increased,the expression of GATA-3 protein decreased,1)P<0.05;compared with MI group,in metoprolol group,the expression of T-bet protein decreased,the expression of GATA-3 protein increased,2)P<0.05.

圖6 免疫印跡法檢測心肌組織Kv2.1、KIR2.1表達Fig.6 Kv2.1 and KIR2.1 expression in myocardial tissue by Western blotNote: 1.Sham group;2.MI group;3.L-metoprolol group;4.M-metoprolol group;5.H-metoprolol group.

表7 各組心肌組織Kv2.1、KIR2.1蛋白表達比較(n=6，

GroupsKv2.1/β-actinKIR2.1/β-actinSham11.43±0.160.86±0.08MI0.27±0.041)0.15±0.031)L-metoprolol0.38±0.052)0.31±0.062)M-metoprolol0.65±0.082)0.45±0.072)H-metoprolol0.81±0.112)0.71±0.112)

Note:Compared with Sham group,in MI group,the expression of Kv2.1,KIR2.1 decreased,1)P<0.05;compared with MI group,in metoprolol group,the expression of Kv2.1,KIR2.1 increased，2)P<0.05.

3 討論

本研究采用結扎左冠狀動脈前降支法制備MI大鼠模型，發現MI組大鼠心肌梗死面積顯著增加，表明大鼠心肌組織受損。過往研究顯示心肌缺血過后會進一步引發心功能受損，造成左心室重構和心衰[2]。本研究發現MI大鼠心臟舒張功能受損，舒張時間和心臟血液灌注時間縮短，心肌供血減少，表明心肌梗死大鼠心室功能損傷、血液動力學異常。以上提示左冠狀動脈前降支結扎法能夠成功復制心肌梗死模型，引發大鼠心肌損傷。

美托洛爾(Metoprolol)為β1受體阻滯劑，可改善心肌供血，降低心肌氧耗，保護心臟功能，在冠心病、心力衰竭、心肌梗死等心臟疾病治療中應用較多[10]。臨床研究顯示，Metoprolol對心力衰竭治療效果較好，可提高患者心功能，降低機體炎癥反應和心肌重塑風險[11]。動物研究顯示Metoprolol可緩解大鼠心肌細胞凋亡，進而抑制心室重塑，保護心臟功能[12]。本研究通過給予MI大鼠Metoprolol干預后發現，與MI組相比，Metoprolol各組大鼠心肌梗死面積顯著降低，且大鼠心臟過度收縮得到緩解，心室舒張壓降低，表明Metoprolol可恢復心肌缺血后心室結構的改變，進而改善大鼠心功能及血流動力學。以上結果均提示Metoprolol能夠改善MI大鼠心功能，發揮心肌損傷保護作用。

近期研究發現MI患者血清中存在大量的炎癥胞如巨噬細胞、T淋巴細胞以及高水平的Th1型炎癥細胞因子，如IFN-γ、IL-2，低水平Th2型炎癥細胞因子如IL-4、IL-6、IL-10等[13]。過往研究證實MI患者冠脈阻塞區域炎癥反應升高，其中Th1細胞介導的免疫反應被激活且IFN-γ、IL-2炎癥因子水平升高，患者Th1/Th2淋巴細胞失衡[14]。Yang等[15]研究發現MI以及動脈粥樣硬化患者中Th1細胞被激活后，血清中IFN-γ、IL-2炎癥因子水平升高，會進一步導致斑塊的不穩定性，加重病情。本研究發現MI組大鼠脾臟淋巴液中Th1細胞比率升高，Th2細胞比率降低，血清IFN-γ、IL-2水平升高，IL-4、IL-10水平降低，提示MI大鼠體內促炎癥反應較強烈，Th1/Th2淋巴細胞失衡。給予Metoprolol干預后Th1細胞比率降低，Th2細胞比率升高，血清IFN-γ、IL-2水平降低，IL-4、IL-10水平升高，呈劑量依賴性，提示Metoprolol可通過調控Th1/Th2細胞平衡，降低機體過度炎癥反應，保護MI大鼠。T-bet和GATA-3分別是Th1、Th2細胞特異轉錄因子，通過檢測T-bet和GATA-3水平能夠反映Th1/Th2細胞比例變化情況[16]。本研究對脾臟、心肌組織中的T-bet和GATA-3蛋白進行檢測，發現MI大鼠脾臟、心肌組織T-bet蛋白表達均顯著升高，GATA-3蛋白表達均顯著降低，經Metoprolol干預后脾臟、心肌組織T-bet蛋白表達均顯著降低，GATA-3蛋白表達均顯著升高，脾臟組織中的Th細胞分泌特異性因子也可進入心肌組織，脾臟Th1/Th2細胞轉錄因子T-bet、GATA-3蛋白表達變化會影響心肌組織中T-bet、GATA-3蛋白表達變化，推測Metoprolol通過上調GATA-3轉錄因子，下調T-bet轉錄因子，恢復Th1/Th2平衡，進而緩解大鼠心肌損傷。

鉀離子通道在心肌細胞電生理調控中起著重要作用，心肌細胞鉀離子通道包括三種亞型，緩慢激活延遲整流鉀電流Iks、快速激活延遲整流鉀電流IKr、超快速激活延遲整流鉀電流IKur，其中IKs、IKr在其中占有重要作用[17]。Kv2.1屬于Shab家族，在整個心臟均有分布，是Iks的重要通道蛋白。過往研究發現心力衰竭大鼠Kv2.1蛋白表達顯著降低，推測這可能為造成心肌細胞電生理不穩定的重要分子機制[18]。KIR2.1屬于KIR2x家族重要組成成員，在維持細胞靜息電位及鉀離子電位平衡調節中發揮重要作用，研究顯示其在心肌細胞IK中占80%[19]。Zhai等[20]研究顯示KIR2.1被抑制后能夠誘發心律失常，且發生心肌缺血及MI后，心肌組織中KIR2.1水平下降。本研究發現MI組大鼠心肌組織中Kv2.1、KIR2.1蛋白表達明顯降低，而給予Metoprolol后，心肌組織中Kv2.1、KIR2.1蛋白表達明顯升高，提示Metoprolol可通過上調Kv2.1、KIR2.1蛋白，調節心肌細胞鉀離子電位平衡，進而保護MI大鼠心肌。最近研究發現調控Th1/Th2平衡向Th1移動，則可減弱鉀通道KIR2.1的表達[5]，結合以上研究推測Metoprolol可能通過調節Th1/Th2平衡，影響鉀通道蛋白Kv2.1、KIR2.1的表達，進而維持心肌細胞鉀離子電位平衡，發揮對MI大鼠心肌保護的作用。

綜上所述，Metoprolol可能通過影響MI大鼠Th1/Th2細胞免疫平衡，進而上調鉀通蛋白Kv2.1、KIR2.1表達，減少MI大鼠梗死面積，保護心功能，然而本研究僅在體內進行研究，Metoprolol是否可在體外通過影響Th1/Th2細胞免疫平衡調節鉀通道蛋白表達，還有待后續深入探究。