腦紋狀體內植入CREB基因修飾的BMSCs對帕金森大鼠學習記憶能力影響的實驗研究①

余 恒 宋光捷

(襄陽市中心醫院，湖北省文理學院附屬醫院北院區神經內科，襄陽 441003)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一種常見于中老年的神經系統變性疾病，以腦黑質紋狀體內多巴胺(dopamine，DA)使神經元發生變性缺失為主要病理特征[1]。近年來其發病率隨人口老齡化逐漸上升，每年患病率達15/10萬～328/10萬人口，對社會和經濟造成嚴重影響[2]。環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB)是一種調節基因轉錄的蛋白質，被蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、PKC等磷酸化后可參與調控機體學習記憶[3]。同時有研究證實骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)可通過腦內移植改善PD大鼠靜止性震顫、動作遲緩等運動障礙癥狀[4]。研究顯示PD患者學習記憶障礙與p-CREB表達異常密切相關[5]。然而目前未見CREB基因對PD大鼠學習記憶能力影響的研究。因此本研究就腦紋狀體內植入CREB基因修飾BMSCs對PD模型大鼠學習記憶障礙的影響進行探討，現報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康雄性Wistar大鼠37只，SPF級，6周齡，體質量180～200 g，購于上海上藥第一生化藥業有限公司，生產許可證SCXK(滬)2016-0002。

1.1.2試劑與儀器 眼科剪(上海千盛生物科技有限公司)，DMEM-LG培養液(北京普博欣生物科技有限責任公司)，CO2培養箱(無錫旭野科技有限公司)，美國Thermo Scientific離心機，總RNA提取試劑盒(武漢鴻雨新科技有限公司)，DNA連接酶(北京合生基因科技有限公司)，Lipofectin 2000(美國Invitrogen公司)，戊巴比妥鈉溶液(石家莊北方藥業有限公司)，腦立體定位儀(北京吉安得爾科技有限公司)，乙醇(上海滬宇生物科技有限公司)，微量進樣器(北京同德創業科技有限公司)，6-羥基多巴胺(6-OHDA)溶液BCA試劑盒(北京寰宇科創科技發展有限公司)，阿撲嗎啡(APO)溶液(美國Sigma公司)，PBS溶液(上海哈靈生物科技有限公司)，研磨器(北京安智盈科技有限公司)，RIPA裂解液(上海迪申生物技術有限公司)，p-CREB一抗(北京博奧森生物技術有限公司)，GAPDH一抗(上海合星生物科技有限公司)，山羊抗兔二抗(北京博爾西科技有限公司)，ECL發光試劑盒(美國Santa Cruz公司)，離心機(美國Thermo scientific)。

1.2方法

1.2.1CREB-BMSCs構建 BMSCs分離培養：選取1只 Wistar大鼠處死，取出雙下肢股骨，眼科剪取股骨髁，PBS溶液沖洗骨髓腔，將獲得的骨髓細胞懸浮液使用離心機1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用DMEM-LG培養液重懸，于37℃、5% CO2培養箱培養，細胞貼壁后換液，繼續培養至細胞生長密度達80%以上消化、傳代，取第三代BMSCs用于后續研究。pCDNA3.1(+)-CREB表達載體構建：取Wistar大鼠腦紋狀體，勻漿裂解，采用總RNA提取試劑盒提取總RNA，總RNA逆轉錄成cDNA，以此cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物與pCDNA3.1(+)同時用Xho I和BamHⅠ限制性內切酶30℃酶切過夜，電泳，回收pCDNA3.1(+)和CREB片段。pCDNA3.1(+)和CREB片段用T4 DNA連接酶連接，構建pCDNA3.1(+)-CREB表達載體。CREB-BMSCs構建：取第三代BMSCs于6孔板中培養，其密度達到80%時，通過Lipofectin 2000將重組真核表達載體pCDNA3.1(+)-CREB轉染至BMSCs，構建CREB-BMSCs。

1.2.2PD模型制備及分組 參照文獻[6]制備PD模型36只Wistar大鼠適應性喂養7 d后，給予0.2 ml/100 g 2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射以麻醉大鼠，麻醉完成后將大鼠綁定于腦立體定位儀，頭部剃毛，顱頂75%乙醇消毒，沿正中線切開頭皮，暴露顱骨，根據《大鼠腦立體定位圖譜》定位大鼠腦紋狀體[6]，以微量進樣器吸取8 μl 6-OHDA溶液注入大鼠腦紋狀體內，縫合術口，麻醉恢復后正常飼養。造模后第2周，腹腔注射0.4 ml APO溶液，誘導大鼠轉圈，當大鼠出現旋轉行為時，計時30 min，每分鐘旋轉超過7圈的大鼠即為造模成功。選取造模成功大鼠30只，隨機分為PBS注射組、BMSCs移植組、CREB-BMSCs移植組，PBS注射組大鼠腦紋狀體內注射10 μl PBS溶液，BMSCs移植組大鼠腦紋狀體內注射10 μl BMSCs(1×104個/μl)，CREB-BMSCs移植組大鼠腦紋狀體內注射10 μl CREB-BMSCs(1×104個/μl)。

1.2.3觀測項目 ①PD大鼠誘導轉圈行為變化：移植2周、5周、8周后，腹腔注射APO誘導大鼠轉圈，當大鼠出現旋轉行為時開始計時，時長為30 min，記錄每分鐘首尾相接旋轉的平均轉圈數。②PD大鼠學習記憶能力變化：采用Morris水迷宮實驗檢測，具體如下：水迷宮為原形水池，水溫(23±2)℃，平臺位于西南象限，低于水面2 cm。首先進行獲得性訓練，將大鼠從西南、東南、東北、西北4個象限放入水中，大鼠爬上水下平臺5 s后結束該次訓練，若大鼠60 s內未找到平臺，則引導大鼠至水下平臺停留10 s，共訓練5 d，4次/d，每次間隔20 min。所有PD大鼠獲得性訓練結束后第2天進行空間探索測試，移除水下平臺，將大鼠從原平臺象限的對側象限放入池內，讓其在圓形水池內自由游泳，利用攝像裝置記錄大鼠30 s內在目標象限(原放置平臺的象限)內停留時間。③PD大鼠腦紋狀體內p-CREB蛋白水平變化：采用Western blot法檢測，具體如下：取各組大鼠，麻醉，迅速取出腦紋狀體，PBS清洗腦組織后置于研磨器內，加RIPA裂解液裂解30 min，以離心機4℃離心10 min，提取蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，定量。取總蛋白上樣，電泳，轉膜，封閉，1∶500稀釋的p-CREB一抗、1∶1 000稀釋的GAPDH一抗，4℃孵育過夜，洗膜，加入1∶20 000稀釋的山羊抗兔二抗，25℃孵育 90 min，洗膜，ECL發光試劑盒顯色，洗片后顯影、定影，分析p-CREB蛋白表達。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件對試驗所有數據進行分析，采用單因素方差分析比較3組PD大鼠旋轉圈數、學習記憶能力變化、p-CREB表達。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1PD大鼠誘導轉圈行為變化 移植2周、5周、8周后，BMSCs移植組PD大鼠旋轉圈數明顯低于PBS注射組(P<0.05)，CREB-BMSCs移植組PD大鼠旋轉圈數明顯低于BMSCs移植組(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2PD大鼠學習記憶能力變化 移植2周、5周、8周后，BMSCs移植組PD大鼠在Morris水迷宮目標象限內的停留時間明顯多于PBS注射組(P<0.05)，CREB-BMSCs移植組PD大鼠在Morris水迷宮目標象限內的停留時間明顯多于BMSCs移植組(P<0.05)，見表2、圖2。

2.3PD大鼠p-CREB蛋白水平變化 移植2周、5周、8周后，BMSCs移植組PD大鼠p-CREB蛋白水平明顯高于PBS注射組(P<0.05)，CREB-BMSCs移植組PD大鼠p-CREB蛋白水平明顯高于BMSCs移植組(P<0.05)，見表3、圖3。

Groups2 weeks5 weeks8 weeksPBS injection group11.11±0.8810.90±0.6910.69±0.70BMSCs transplantation group8.29±0.581)5.69±0.801)3.55±0.591)CREB-BMSCstransplantation group7.49±0.791)2)4.71±0.901)2)2.95±0.801)2)F62.53172.42376.32P<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with PBS injection group,1)P<0.05;compared with BMSCs transplantation group,2)P<0.05.

圖1 移植后PD大鼠旋轉圈數Fig.1 Number of rotations of PD rats after transplantationNote: Compared with PBS injection group，*.P<0.05；compared with BMSCs transplantation group，#.P<0.05.

Groups2 weeks5 weeks8 weeksPBS injection group8.66±1.309.95±1.0510.97±0.89BMSCs transplantation group11.71±1.291)15.18±1.411)19.35±1.491)CREB-BMSCstransplantation group14.29±0.881)2)20.42±1.301)2)26.38±1.751)2)F57.72171.98293.94P<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with PBS injection group,1)P<0.05;compared with BMSCs transplantation group,2)P<0.05.

圖2 移植后PD大鼠在Morris水迷宮目標象限內的停留時間Fig.2 Retention time of PD rats in Morris water maze target quadrant after transplantationNote:Compared with PBS injection group,*.P<0.05;compared with BMSCs transplantation group,#.P<0.05.

Groups2 weeks5 weeks8 weeksPBS injection group0.05±0.020.06±0.010.06±0.02BMSCs transplantation group0.16±0.031)0.27±0.051)0.38±0.041)CREB-BMSCstransplantation group0.28±0.021)2)0.49±0.041)2)0.58±0.061)2)F233.53330.24368.57P<0.001<0.001<0.001

Note:Compared with PBS injection group,1)P<0.05;compared with BMSCs transplantation group,2)P<0.05.

圖3 移植后PD大鼠p-CREB蛋白水平Fig.3 p-CREB protein level in PD rats after transplantationNote: Compared with PBS injection group，*.P<0.05；compared with BMSCs transplantation group，#.P<0.05.

3 討論

PD是一種錐體外系變性疾病，主要因腦黑質紋狀體內DA合成減少，乙酰膽堿 (acetylcholine，Ach) 興奮作用增強所致[7]。臨床癥狀主要表現為運動障礙(如動作遲緩、靜止性震顫等)與非運動障礙(如自主神經功能障礙、認知功能減退、感覺喪失等)[8]。目前臨床治療PD主要采用手術干預治療和藥物替代治療，手術干預治療可直接針對病灶，但手術創傷可導致PD病情加重[9]。藥物替代治療對早期病情緩解有一定效果，但長期服用左旋多巴等藥物易產生藥物依賴性，加重認知障礙的風險[10]。而具有副作用小、安全等優點的基因治療已成為近年來PD治療的研究熱點[11]，可將目的基因修飾的細胞導入腦內干擾蛋白表達，阻止DA神經元變性缺失。

BMSCs是一種來源廣泛的靶細胞，易增殖、分化且基因易修飾[12,13]，因此本研究從Wistar大鼠兩側股骨中取BMSCs，將其培養至第三代用于后續實驗。研究發現酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、CREB等基因可用于基因治療[14]，其中CREB是Montrminy等[15]發現的一種細胞核蛋白，廣泛存在于腦內各種神經元中，可與環磷酸腺苷反應元件(cyclic adenosine monophosphate response element，CRE)特異性結合，其分子結構中含有天冬氨酸(asparagic acid，ASP)區域、蛋氨酸區域、激酶誘導區域(kinase-inducing region，KID)等結構域，其中ASP區域可與啟動子結合，蛋氨酸區域可促進基因轉錄，KID區可促進CREB發生磷酸化，p-CREB可保護損傷神經元，而這種保護作用是通過與CRE結合后調節GDNF、BDNF等因子表達來促進細胞修復，抑制神經元凋亡[3]。同時，長時程增強(long-term potentiation，LTP)形成、神經元生長、突觸可塑性均依賴于CREB功能的正常。另有研究發現CREB是記憶儲存中必不可少的轉錄因子[16]，與學習記憶密切相關，而學習記憶障礙是PD病程的重要表現之一。因此本研究采用CREB基因修飾BMSCs，并將其植入PD大鼠，發現移植2周、5周、8周后CREB-BMSCs移植組PD大鼠旋轉圈數明顯低于BMSCs移植組及PBS注射組，說明CREB-BMSCs植入PD大鼠腦紋狀體后的改善效果明顯優于BMSCs移植。Morris水迷宮實驗發現，CREB-BMSCs移植組PD大鼠在Morris水迷宮目標象限內的停留時間明顯多于BMSCs移植組及PBS注射組，說明CREB-BMSCs植入PD大鼠腦紋狀體后大鼠學習記憶能力較BMSCs移植恢復的更好。此外Western blot結果顯示BMSCs移植組PD大鼠p-CREB蛋白表達量明顯高于PBS注射組，CREB-BMSCs移植組PD大鼠p-CREB蛋白表達量明顯高于BMSCs移植組，提示CREB-BMSCs可明顯促進PD大鼠p-CREB水平的提高。

綜上所述，腦紋狀體內植入CREB基因修飾的BMSCs可有效改善帕金森大鼠學習記憶能力，由此為帕金森病基因治療提供了新的方向。但這種方法可否應用于臨床實踐仍需進一步研究。