miR-133a-3p通過抑制氧化還原因子1抑制肝癌細胞惡性生物學行為①

李天雄 孫志鵬 尹 剛 閆 巍 阿民布和 張能維

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院胃腸肝膽腫瘤外科,北京 100038)

肝癌在我國的發病率逐年升高，對國民的身體健康構成極大危害。作為一種惡性腫瘤，多種因素參與肝癌的發生發展過程，其高轉移性和侵襲性是個多步驟發生的過程[1]。隨著現代人生活方式的改變，肝癌的發病率越來越高，發病人群也越來越年輕，但其發病原因尚不明確。研究證明miRNA具有與癌癥進展相關的多種生物學作用，包括細胞的存活、分化、增殖、凋亡、遷移。許多研究已經證明miRNA與多種腫瘤的發生發展密切相關[2]。有報道指出miR-494可以通過靶向Ⅰ型膠原α1基因(collagen type I alpha 1，COL1A1)加劇口腔鱗狀細胞癌[3,4];miR-33a通過靶向核轉錄因子GATA6抑制結腸癌細胞的活力和侵襲[5]。同時，文獻報道miR-133可作為腫瘤抑制因子在多種轉移性癌癥中發揮作用，并證明miR-133通過直接靶向垂體腺瘤中的叉頭框蛋白C1(forkhead box protein C1,FOXC1)來抑制細胞的遷移和侵襲[6]。研究證實miR-133的高表達能夠抑制肺癌細胞的遷移和侵襲[7]。然而，沒有明確的證據表明miR-133a-3p與肝癌之間的關系。有研究證明氧化還原因子1(redox factor-1，Ref-1)可以作為腫瘤啟動子調節腫瘤發生發展過程，其與腫瘤和其他疾病密切相關[8]。Guo等[9]發現肺癌細胞中Ref-1的表達水平顯著上升，Ref-1的高表達導致患者術后總體存活率更差。Lee等[10]已證實Ref-1有助于人膀胱癌的分化和轉移。雖然不同的文獻報道揭示Ref-1與多種不同腫瘤之間的結合相互作用，但是Ref-1與肝癌之間關系鮮有報道。

本研究主要探討miR-133a-3p是否可以抑制肝癌細胞的惡性生物學特性，并進一步研究其與Ref-1的關系，揭示兩者之間相互作用對肝癌進展內在機制的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織樣本 從2017年2月～2018年12月在首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院接受腹腔鏡精準肝切除術的肝癌患者獲得23對肝癌組織和鄰近肝癌組織樣品。將組織樣品立即冷凍并儲存在液氮中。患者和家屬對本研究知情同意，且該研究獲得本院倫理委員會批準。

1.1.2試劑與儀器 HepG2、Huh-7、SK-Hep1、SMMC-7721和Hep-3B等肝癌細胞以及人正常肝細胞系HL-7702購自中科院上海細胞庫；miR-mimics、miR-NC購自上海吉凱公司；蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)細胞裂解液、結晶紫、高錳酸鉀、草酸、冰醋酸和磷鎢酸均購自西安科昊生物有限公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏試劑生物有限公司，高糖DMEM培養基 、優級胎牛血清、胰蛋白酶消化液均購自美國 HyClone，青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛、天狼星紅染液、苯胺藍和蘇木素均購自北京碧云天有限公司，Actin、N-cadherin、Snail、Slug抗體及兔二抗均購自英國 Abcam；ECL化學發光試劑盒購自美國 Advansta，Transwell小室購自康寧；qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司；生物芯片分析系統為Agilent Bioanalyzer 2100。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR TRIzol試劑用于提取總RNA。使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。qRT-PCR檢測目的基因RNA的相對表達水平。設定反應條件：95℃熱激活10 min，95℃10 s，60℃ 20 s，72℃ 35 s。2-ΔΔCt方法用于計算目的基因相對mRNA表達。引物序列見表1。

1.2.2細胞轉染 將細胞隨機分配到不同組，用miR-133a-3p-mimics(miR-mimics)和相應的陰性對照(miR-NC)轉染，設置未經轉染的細胞做空白對照組(Control)，每組包含3×105個細胞。轉染前24 h將細胞接種在6孔板中，融合30%～40%。每次轉染使用miR-mimics和miR-NC(各20 nmol/L)。

1.2.3CCK-8增殖實驗 調整細胞數4×105個/孔直接鋪板，37℃，5%CO2培養箱內培養1～4 d。結束后每孔加入20 μl CCK-8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。設置酶標儀波長450 nm檢測細胞CCK-8混合液OD值進行活力分析。

1.2.4克隆形成實驗 對數生長期細胞，胰蛋白酶消化計數，6孔板，每孔300個細胞，2 ml培養液，培養15 d后，PBS沖洗，室溫風干，結晶紫染色，計數。

1.2.5細胞劃痕實驗 胰蛋白酶消化對數生長期細胞，接種至6孔板，培養箱設定37℃、5%CO2進行培養，每孔2 ml DMEM培養液，細胞密度至80%時，細胞劃痕，劃痕后更換無血清培養液，0 h、6 h、12 h各拍照一次。

1.2.6Transwell侵襲實驗 胰蛋白酶消化對數生長期細胞，無血清的DMEM培養液調整細胞密度至5×104個/ml，Transwell下室加入含10%胎牛血清DMEM培養液600 μl，上室先鋪水化的BD膠基底膜，再加200 μl無血清細胞懸液。鋪板24 h后PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，室溫自然風干。結晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，棉簽輕輕擦去上層未遷移的細胞，33%乙酸脫色，酶標儀570 nm讀值。

1.2.7RNA轉錄組測序 檢測RNA質量，RNA完整性數(RIN)>8的樣品用于RNA-seq測定。首先用DNA酶Ⅰ處理RNA樣品以降解任何可能的DNA污染。然后通過使用Oligo(dT)磁珠富集mRNA。與片段化緩沖液混合，將mRNA片段化成短片段。然后通過隨機六聚體引物合成cDNA的第一鏈。加入緩沖液，dNTP，RNase H和DNA聚合酶Ⅰ以合成第二條鏈。用磁珠純化雙鏈cDNA。然后進行末端修復和3′-末端添加單核苷酸A(腺嘌呤)。最后，將測序銜接子連接到片段上。通過PCR擴增富集片段。在質量控制(QC)步驟中，對樣品庫進行鑒定和定量，測序文庫產物。將稱為原始讀數的初級測序數據進行QC檢測以確定是否需要重新測序。在QC之后，將原始讀數過濾成干凈的讀數，與參考序列比對。進行QC校準以確定是否需要重新測序。比對數據用于計算參考基因的讀數分布和映射比率。比對結果通過QC后，進行下游分析，包括基因表達和基于基因表達的深度分析，如：PCA、相關性、篩選差異表達基因(DEGs)等。基于DEG進一步深度分析，包括GO富集分析、KEGG通路富集分析，聚類分析，蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析和DEGs分析。

表1 引物序列

Tab.1 Sequences of primers

GeneSequences(5′-3′)miR-133a-3pFATTTTTCCCTCGACACCCGATRTCCCAGCCGTAGACCAARef-1FAGCCAACGTTAACTGAGGAGTRGGCAAGTTGATTGGAGGGATGIGFBP1FAGCCAACGTTAAATGAGGACAGRGGCAAGTTGATTGATGGGAGGSSTFAGCCAAGAGTTAACTCGTGAGRGGCATTAGGATTGATGGAGGGβ-actinFACCCACTCCTCCACCTTTGRCACCACCCTGTTGCTGTAG

1.2.8Western blot 調整細胞濃度為5×104個/ml，80%細胞密度時收集細胞，PBS洗滌1 min后加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解，30 min后高速離心吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE電泳后轉膜，轉膜成功后用脫脂牛奶封閉，PBST清洗，1∶1 000稀釋一抗，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復沖洗，條帶發光拍照。

1.2.9免疫組化 石蠟切片脫蠟和水化,修復抗原,滴加封閉液，加一抗，PBS沖洗,滴加生物素標記的二抗,PBS沖洗。滴加鏈親和素-過氧化物酶溶液孵育。DAB顯色,蘇木素復染,中性樹膠封固，PBS 緩沖液代替一抗作陰性對照,陽性細胞槳著色為棕黃色。

2 結果

2.1miR-133a-3p在肝癌組織和癌旁組織以及不同肝癌細胞系中的表達情況 通過qRT-PCR對23對癌組織和癌旁組織進行分析檢測，結果顯示miR-133a-3p在癌組織中的表達明顯低于癌旁組織(P<0.05)，見圖1A。提示miR-133a-3p在肝癌組織中表達過低可能與肝癌的發生有一定的關系。檢測miR-133a-3p在五種肝癌細胞系HepG2、Huh-7、SK-Hep1、SMMC-7721、Hep-3B和人正常肝細胞系HL-7702中的表達，結果發現miR-133a-3p在五種肝癌細胞系中的表達均低于HL-7702，在HepG2的表達最低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1B。

圖1 miR-133a-3p在各組織中的表達Fig.1 Expression of miR-133a-3p in tissuesNote: A.Expression of miR-133a-3p in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues;B. Expression of miR-133a-3p in five hepatocellular carcinoma cell lines and normal hepatocytes.***.P<0.001.

圖2 miR-133a-3p在HepG2細胞轉染前后各組中的表達Fig.2 Expression of miR-133a-3p in HepG2 cells before and after transfectionNote: ***.P<0.001.

圖3 HepG2細胞轉染前后細胞增殖及克隆形成能力變化Fig.3 Changes of cell proliferation ability and clonogenic ability before and after transfectionNote: A.CCK-8 was used to detect the changes of cell proliferation ability;B.Clonogenic assay was used to detect the changes of cell clonogenic ability.***.P<0.001.

2.2HepG2細胞轉染前后細胞增殖和克隆形成能力變化 miR-mimics和miR-NC分別轉染HepG2細胞，結果顯示miR-mimics轉染組HepG2細胞中miR-133a-3p表達顯著增加(P<0.05)，見圖2。CCK-8檢測HepG2細胞轉染前后細胞的增殖能力，結果顯示miR-133a-3p過表達顯著抑制HepG2細胞的增殖能力(P<0.05)，見圖3A；克隆形成實驗顯示了同樣的結果，miR-133a-3p過表達后，HepG2細胞克隆形成數明顯少于對照組(P<0.05)，見圖3B。

2.3HepG2細胞轉染前后細胞遷移和侵襲能力變化 細胞劃痕和Transwell侵襲實驗發現miR-133a-3p在HepG2細胞過表達后可以抑制細胞遷移和侵襲能力(P<0.05)，見圖4。

圖4 HepG2細胞轉染前后細胞劃痕愈合能力及侵襲能力變化Fig.4 Changes of wound healing ability and invasive ability of HepG2 cells before and after transfect-ionNote: A.Wound healing ability;B.Invasive ability.**.P<0.005;***.P<0.001.

圖5 RAN-seq檢測HepG2細胞轉染前后各基因RNA水平變化Fig.5 RAN-seq was used to detect changes of gene RNA levels in HepG2 cells before and after transfectionNote: Reds means up,blue means down.

圖6 qRT-PCR檢測miR-mimics組細胞下調倍數最高的3個基因Fig.6 qRT-PCR was used to detect three genes with highest down-regulation ratio in miR-mimics groupNote:**.P<0.01.

圖7 HepG2細胞轉染前后Ref-1表達變化Fig.7 Expression of Ref-1 in HepG2 cells before and after transfectionNote: A.Detected with qRT-PCR;B.Detected with Western blot.***.P<0.001.

圖8 Ref-1在各組織中的表達Fig.8 Expression of Ref-1 in tissuesNote:A.Expression of Ref-1 in hepatocellular carcinoma tissues and normal tissues(100 μm);B.Expression of Ref-1 in five hepatocellular carcinoma cell lines.***.P<0.001.

圖9 聯合干預后HepG2細胞miRNA-133a-3p和Ref-1表達情況Fig.9 Expression of miRNA-133a-3p and Ref-1 in HepG2 cells after combined interventionNote:***.P<0.001.

圖10 聯合干預后HepG2細胞增殖、遷移及侵襲能力變化Fig.10 Proliferation, migration and invasive ability of HepG2 cell after combined interventionNote:A.Proliferation;B.Migration;C.Invasive.

2.4RNA轉錄組測序檢測HepG2細胞轉染前后各基因RNA差異變化 利用RNA-seq技術檢測了HepG2細胞轉染前后各基因在RNA水平表達差異，發現Ref-1、胰島素樣生長因子結合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein 1，IGFBP1)和可溶性生長刺激表達蛋白(soluble growth stimulating protein，SST)下調倍數位于前三名，通過KEGG通路富集分析發現其均與腫瘤增殖通路相關,見圖5；用qRT-PCR對miR-mimics組HepG2細胞進行了驗證，發現結果與RNA-seq保持一直，其中Ref-1下調倍數最高(P<0.05)，見圖6(所有結果均轉為正數計算)。

2.5HepG2細胞轉染前后Ref-1表達變化 根據RNA-seq檢測分析結果， qRT-PCR和Western blot檢測發現Ref-1隨著miR-133a-3p的增加而降低，呈負相關作用，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

2.6Ref-1在肝癌組織和肝癌細胞系中的表達 免疫組化和qRT-PCR結果表明，Ref-1在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(P<0.05)，見圖8A；在肝癌細胞系中的表達顯著高于正常肝細胞系，且在HepG2細胞中的表達最高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖8B。

2.7miR-133a-3p和Ref-1聯合干預后HepG2細胞增殖和遷移侵襲能力變化 HepG2細胞同時轉染miR-mimics和si-Ref-1，進行聯合干預，結果顯示miR-mimics轉染組HepG2細胞中miR-133a-3p表達顯著增加，而Ref-1幾乎無表達(P<0.05)，見圖9。CCK-8檢測結果顯示聯合干預后更加顯著地抑制了HepG2細胞增殖能力(P<0.05)，見圖10A；細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗顯示了同樣的結果，聯合干預后HepG2細胞遷移和侵襲能力抑制效果更加明顯(P<0.05)，見圖10B、C。

3 討論

肝癌被認為是消化系統疾病惡性程度較高的癌癥之一，其發病率在我國逐年上升。盡管肝癌的治療已經有所改善，但由于其存活率較低，目前研究熱點更多集中在肝癌新的靶向治療[11]。基因治療作為一種新策略，已經取得了有效的成果。本研究主要關注miR-133a-3p和Ref-1在肝癌中的功能作用。根據實驗結果得出結論，miR-133a-3p可通過靶向Ref-1抑制肝癌細胞增殖和遷移侵襲等惡性生物學行為，同時降低Ref-1的表達。

有研究報道miR-133a在不同類型的多種惡性腫瘤中作為一種腫瘤抑制因子起到抑制腫瘤的作用，尤其是在胃腸系統中。Zhang等[12]證明miR-133a可以有效抑制胃癌細胞周期進程。同時，Jia等[13]研究可知miR-133a可促進腫瘤細胞凋亡，抑制膀胱癌的細胞增殖和遷移。為了進一步研究miR-133a-3p在肝癌中的作用和分子機制，本研究首先用qRT-PCR檢測miR-133a-3p在肝癌組織和細胞系中的表達情況，結果顯示miR-133a-3p在肝癌組織和肝癌細胞系中顯著下調，并且在HepG2細胞中下調倍數最高。在其他類型的人類惡性腫瘤中，如食管癌，肺癌，膀胱癌和結腸直腸癌等，有數據分析表明miR-133a-3p降低了腫瘤細胞的增殖，侵襲和遷移能力[14]。此外，CCK-8和克隆形成實驗分析表明，miR-133a-3p的上調顯著抑制了HepG2細胞增殖和克隆形成能力，而細胞劃痕和Transwell實驗結果表明miR-133a-3p過表達后明顯抑制了HepG2細胞的劃痕愈合能力和細胞侵襲能力，這些結果表明miR-133a-3p在肝癌發生發展過程中起到腫瘤抑制因子的作用，其過表達后可以有效抑制肝癌HepG2細胞的惡性生物學行為。

至于進一步的機制，本研究假設miR-133a-3p通過調節相應的基因來調節肝癌細胞的惡性生物學能力。采用RNA-seq的方法，檢測了miR-133a-3p過表達前后HepG2細胞中基因在RNA水平的表達變化，結果發現Ref-1、IGFBP1和SST在miR-133a-3p過表達后下調的倍數位于前三，隨后用qRT-PCR進行了驗證，結果和RNA-seq的結果一致，其中Ref-1的下調倍數最高。qRT-PCR和Western blot檢測miR-133a-3p過表達后Ref-1在RNA和蛋白水平的變化，結果顯示Ref-1隨著miR-133a-3p過表達而顯著降低，說明miR-133a-3p對其具有抑制作用，靶向作用最強。查閱文獻發現Ref-1在多種惡性腫瘤組織中的表達顯著高于癌旁和正常組織。此外，較高的Ref-1的過表達會導致結腸癌患者術后總體存活率降低。因此，為了找到證據證明Ref-1參與肝癌進展的假設，在本研究中，qRT-PCR和Western blot檢測結果證實Ref-1在肝癌細胞和組織中高度表達，這與本課題組之前的生物信息學分析一致。最后，為了研究Ref-1在miRNA-133a-3p抑制肝癌過程中是否發揮了作用，本實驗瞬時轉染了miR-mimics和si-Ref-1進行聯合干預，結果發現聯合干預后肝癌細胞HepG2的惡性生物學行為的抑制作用與miR-mimics組相比更加強烈。進一步證明Ref-1在肝癌發生發展過程中充當致癌基因的角色，沉默其表達與miR-mimics聯合干預后可以產生協同抑癌作用。

綜上所述，本研究揭示了miR-133a-3p通過直接靶向Ref-1并降低其表達來抑制肝癌細胞的增殖和遷移等惡性生物學行為。通過大量的檢測和生物信息學分析，本研究對肝癌在基因水平發生機制有了一定的認識，同時為肝癌的臨床治療提供了可行的靶向治療策略，因此對肝癌無論是致癌機制還是治療思路都提供了一定的實驗依據。臨床上晚期肝癌對放射治療不是很敏感，miR-133a-3p和Ref-1在肝癌放療治療過程中起什么作用，將是下一步研究的重點。