miR-1靶向調控VEGFA肺癌干細胞侵襲和轉移的影響①

羅繼文 陳光明 岑小波

(西南醫科大學附屬中醫醫院胸心外科,瀘州 646000)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，腫瘤相關病死率位居惡性腫瘤榜首。數據顯示2018年肺癌新發確診病例約占全部惡性腫瘤新發病例的15%左右，死亡病例約占全部惡性腫瘤死亡病例的25%左右。雖然肺癌的治療取得了一定進展，但是肺癌患者5年生存率仍然較低，僅有15%左右[1-3]。目前已經證實肺癌細胞中存在多種基因突變，包括EGFR、KRAS、p53和PTEN等基因，但是肺癌的發生發展機制尚未完全明確[4,5]。腫瘤的發生發展與腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)密不可分，CSCs在腫瘤增殖、侵襲、轉移、復發和耐藥等生物過程中均發揮重要作用[6-8]，攻克CSCs將為腫瘤的治療帶來巨大希望。研究表明CSCs受多種因素的調控等，包括遺傳、表觀遺傳和腫瘤相關信號通路，miRNAs屬于表觀遺傳學范疇，在轉錄后水平調控基因的表達，其異常表達可引起包括人類惡性腫瘤在內的疾病，研究發現miRNAs可以調控CSCs的增殖、侵襲、轉移等生物學行為，并發揮關鍵作用[9-14]。miR-1在肺癌、肝癌、卵巢癌和前列腺癌等常見惡性腫瘤中被鑒定為抑癌因子，在乳腺癌中miR-1表達下調，可抑制乳腺癌CSCs的增殖，并誘導其凋亡[15-19]。而miR-1與肺癌CSCs的研究尚未見報道，因此本文探討miR-1調控肺癌CSCs生物學功能的作用機制，旨在獲得miR-1作為肺癌潛在作用靶點的重要證據，為肺癌治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 膠原酶購自美國Sigma公司；表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子購自美國Gibco公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit逆轉錄、SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；miR-1、VEGFA、內參GAPDH引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成； DMEM-F12培養基、FBS購自美國Gibco公司；miR-1 mimic和oe-VEGFA質粒購自廣州瑞博公司；Boyden和Transwell小室且美國Coring公司；Nanog、SOX2和OCT4購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1肺癌CSCs的分離培養 收集我院行手術治療的肺癌患者術切除的新鮮組織，患者術前未接受抗腫瘤治療，經病理學專家證實為肺癌組織。操作符合我院倫理委員會要求，所有患者知情同意。離體的新鮮組織立即置于組織保存液中，在無菌環境下去除癌旁組織，生理鹽水沖洗后，剪成米粒大小放入含有膠原酶的無血清DMEM-F12培養基中，37℃搖床上消化2 h。消化終止后，無菌尼龍細胞過濾器過濾棄去組織塊，消化細胞液2 000 r/min離心5 min，將細胞重懸置于含有表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的無血清培養基中懸浮培養，2周左右時腫瘤細胞球形成，將腫瘤細胞球制成單個細胞后與小鼠抗人CD133抗體包被的磁珠孵育，分選出CD133陽性細胞，并置于無血清培養基中繼續擴大培養。

1.2.2Western blot檢測蛋白表達 收集CD133陽性和CD133陰性的細胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，-80℃凍存過夜，超聲裂解30 min后12 000 r/min、4℃離心20 min，檢測蛋白濃度，煮沸變性，冷卻后，蛋白進行SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入Nanog、SOX2、OCT4一抗稀釋液4℃孵育過夜，TBST洗3次后，二抗室溫孵育1 h，ELC化學發光法顯示蛋白條帶。

1.2.3細胞轉染 將呈對數生長的肺癌CSCs細胞傳代至6 cm培養皿中，按說明書將脂質體2000與轉染試劑分別轉染至細胞中，分為NC組和miR-1 mimic組。miR-1 mimic和vector、miR-1 mimic和oe-VEGFA分別轉染至細胞中，分為miR-1 vector組和miR-1 VEGFA組，放置培養箱中培養。

1.2.4qRT-PCR檢測CSCs中miR-1表達水平 收集各組細胞系，采用Trizol裂解法提取總RNA。設計合成miR-1。引物見表1。總RNA逆轉錄的cDNA作為模板，95℃預變性5 s，95℃變性5 s、60℃退火30 s，共40個循環，進行qRT-PCR檢測。測得各樣品的循環閾值(cycle threshold，Ct)，2-ΔΔCt法計算各組實驗數據，以U6為內參計算miR-1相對表達量，GAPDH為內參計算VEGFA相對表達量。

1.2.5Boyden實驗檢測細胞侵襲能力 取各組細胞，以1×106個/孔、100 μl無血清培養基接種于Boyden小室上室，下室加500 μl完全培養基作為趨化因子，放置培養箱中培養，顯微鏡下觀察下室穿入細胞情況，下室穿入10個左右細胞時終止培養，將Boyden小室和下室之間聚碳酸酯微孔膜的上室面細胞洗去后用甲醇固定，蘇木素染色，顯微鏡下隨機計數微孔膜下室面3個視野中的細胞，取其均值代表細胞侵襲能力。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GroupsPrimer sequence miR-1FGCCCGCTGGAATGTAAAGAAGTATGRGTGCAGGGTCCGAGGTVEGFAFCGCTTCGGCAGCACATATACRAGGGGCCATGCTAATCTTCTU6FAGGGCAGAATCATCACGAAGTRAGGGTCTCGATTGGATGGCAGAPDHFACAACTTTGGTATCGTGGAAGGRGCCATCACGC CACAGTTTC

1.2.6Transwell實驗檢測細胞轉移能力 取各組細胞，以1×106個/孔、100 μl無血清培養基接種于Transwell小室上室，下室加500 μl完全培養基作為趨化因子，放置培養箱中培養，顯微鏡下觀察下室細胞穿入情況，下室穿入10個左右細胞時終止培養，將Transwell小室和下室之間聚碳酸酯微孔膜的上室面細胞洗去后用甲醇固定，蘇木素染色，顯微鏡下隨機計數微孔膜下室面3個視野中的細胞，取其均值代表細胞侵襲能力。

1.2.7miR-1靶向調控VEGFA驗證 Target Scan7.1軟件預測miR-1的靶基因。分別將以下4組物質共轉染到CSCs中：VEGFA-wt與miR-1 mimic共轉染組(VEGFA-wt+miR-1)；VEGFA-wt與NC共轉染組(VEGFA-wt+NC)；VEGFA-mut與miR-1 mimic共轉染組(VEGFA-mut+miR-1)；VEGFA-mut與NC共轉染組(VEGFA-mut+NC)，收集轉染48 h的各組細胞，根據雙熒光素酶報道基因檢測說明書檢測各組熒光素酶活性。

2 結果

2.1肺癌CSCs的篩選及鑒定 與CD133陰性細胞相比，CD133陽性細胞中Nanog、OCT4和SOX2的表達顯著增加，表明CD133陽性的細胞為肺癌CSCs，置于無血清培養基中繼續擴大培養進行后續實驗。見圖1。

2.2肺癌CSCs 中miR-1的表達 qRT-PCR檢測CSCs中miR-1的表達水平，結果顯示miR-1在CD133陰性細胞中的表達為1.00±0.05，在CD133陽性細胞(CSCs)中的表達為0.31±0.10，CSCs中miR-1的表達降低(P<0.05)。

2.3miR-1 mimic轉染效果 miR-1 mimic轉染CSCs 48 h后，qRT-PCR結果顯示miR-1在NC組細胞中的表達為1.00±0.04，在miR-1 mimic組細胞中的表達為13.25±0.27，miR-1 mimic組CSCs中miR-1的表達升高(P<0.05)，可進行后續實驗。

2.4miR-1對肺癌CSCs侵襲能力的影響 Boyden實驗結果顯示，NC組穿膜細胞數為(78.31±12.67)個，miR-1 mimic組穿膜細胞數為(19.53±6.92)個。與NC組比較，miR-1 mimic組細胞侵襲能力降低(P<0.05)。見圖2。

2.5miR-1對肺癌CSCs轉移能力的影響 Trans-well實驗結果顯示，NC組穿膜細胞數為(69.95±9.67)個，miR-1 mimic組穿膜細胞數為(37.36±8.61)個。與NC組比較，miR-1 mimic細胞轉移能力降低(P<0.05)。見圖3。

2.6miR-1對VEGFA的調控作用 TargetScan7.1軟件在線預測顯示VEGFA啟動子區有miR-1的結合位點。進一步雙熒光素酶報道基因試驗結果顯示：與VEGFA-wt+NC共轉染組相比，VEGFA-wt+miR-1共轉染組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而VEGFA-mut+NC和VEGFA-mut+miR-1組之間的熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。qRT-PCR結果顯示，與NC轉染組1.00±0.05比較，miR-1 mimic組CSCs中VEGFA mRNA表達水平0.39±0.09下降(P<0.05)。見圖4。

圖1 干性標志蛋白Nanog、OCT4和SOX2在CD133細胞中的表達Fig.1 Expression of stem marker proteins Nanog，OCT4，SOX2 in CD133 cells

圖2 Boyden實驗檢測miR-1對肺癌CSCs侵襲能力影響Fig.2 Effect of miR-1 on invasion of CSCs detected by Boyden test

圖3 Transwell實驗檢測miR-1對肺癌CSCs轉移能力影響Fig.3 Effect of miR-1 on metastasis of CSCs detected by Transwell test

圖4 miR-1對VEGFA的調控作用Fig.4 Regulatory effect of miR-1 on VEGFANote: A.TargetScan7.1 software was used to predicte binding site of VEGFA and miR-1;B.Double luciferase reporter gene test was used to detect VEGFA targeting of miR-1;C.qRT-PCR was used to detect expression level of VEGFA mRNA in miR-1 mimic group;compared with NC group,*.P<0.05.

圖5 Boyden實驗檢測VEGFA對轉染miR-1的CSCs侵襲能力的影響Fig.5 Boyden test was used to detect effect of VEGFA on invasive ability of CSCs transfected with miR-1

2.7VEGFA逆轉miR-1抑制肺癌CSCs侵襲能力 Boyden實驗結果顯示，miR-1 vector組穿膜細胞數為(13.74±7.54)個，miR-1 VEGFA組穿膜細胞數為(46.34±10.78)個。與miR-1 vector組比較，miR-1 VEGFA組細胞侵襲能力升高(P<0.05)。見圖5。

2.8VEGFA逆轉miR-1抑制肺癌CSCs轉移能力 Transwell實驗結果顯示，miR-1 vector組穿膜細胞數為(13.74±7.54)個，miR-1 VEGFA組穿膜細胞數為(46.34±10.78)個。與miR-1 vector組比較，miR-1 VEGFA組細胞轉移能力升高(P<0.05)。見圖6。

圖6 Transwell實驗檢測VEGFA對轉染miR-1肺癌CSCs轉移能力的影響Fig.6 Transwell test was used to detect effect of VEGFA on metastasis of CSCs transfected with miR-1

3 討論

肺癌傳統治療方法包括手術切除、放療和化學治療，以手術切除為主放化療為輔方式的聯合治療對早期肺癌患者治療效果顯著，而大約三分之二的肺癌患者由于腫瘤細胞轉移至淋巴結或遠處器官，使得傳統治療效果不佳[20,21]。腫瘤早期接受治療的患者及治療過程中產生耐藥的患者腫瘤復發率為50%，解決腫瘤侵襲轉移、復發耐藥問題是肺癌治療的關鍵[22,23]。雖然新肺癌治療策略如酪氨酸激酶抑制劑靶向治療和免疫療法等的出現使療效有一定改善，但由于肺癌在腫瘤細胞類型和遺傳、表觀遺傳調控中具有強異質性，導致肺癌患者整體5年生存率并無明顯提高[24,25]，因此需要新的治療方法。最新研究表明，CSCs是腫瘤細胞中一種罕見的亞群，具有干細胞典型特征即具有持續自我更新能力和多分化潛能，且具有高體內致瘤性，因此，CSCs與腫瘤的惡性增殖、侵襲轉移、復發耐藥和異質性等密切相關，抑制CSCs可顯著抑制腫瘤惡性行為[6-10]。研究已經證實CSCs可以作為藥物治療新靶點[26]，研究調控CSCs侵襲和轉移的機制具有重要意義。

CSCs的調控機制具有多樣性，USP37基因在乳腺癌CSCs中過表達，通過調控hedgehog信號通路增加CSCs的干性[27]；敲低Linc-ITGB1的表達可顯著抑制非小細胞肺癌CSCs的形成和SOX2、Nanog、Oct-4、c-Myc和CD133等干性相關基因的表達[28]；在卵巢癌中抑制miR-23a的表達，CSCs的細胞活力、遷移、侵襲、和自我更新能力降低，凋亡增加，作用機制可能為靶向調控DLG2基因[29]。miRNAs屬于內源性非編碼RNA家族，是長度平均約為22個核苷酸的小RNA，其異常表達可以導致包括惡性腫瘤等多種疾病的發生，肺癌細胞中存在miRNAs異常表達譜，可充當癌基因促進肺癌惡性進展[12-14]。研究報道miRNAs在肺癌細胞中可充當藥物靶點，在肺癌細胞中miR-100-5p可逆轉克唑替尼和洛瑞肽的抗性，是抗藥性的潛在治療靶標[30]；miR-1是心肌細胞發育增殖的關鍵調節因子，在哺乳動物心臟發育期間，可在心肌細胞中檢測到miR-1表達，出生后表達急劇上調[31]。大量文獻表明miR-1在腫瘤中表達下調，在肺癌中為抑癌因子，抑制肺癌細胞的致瘤性、侵襲轉移和增加肺癌細胞對化療藥物的敏感性[15-18]。在乳腺癌中過表達miR-1可抑制CSCs增殖并促進腫瘤細胞凋亡[19]，因此miR-1是否參與肺癌CSCs調控引起關注。

CSCs是存在于腫瘤細胞中的一個亞群，對其研究時首先將其分離并擴大培養，根據細胞表面標志物或側群進行分選[32]，本研究中CSCs來自肺癌組織，利用CSCs強大的自我更新能力，在無血清培養基中形成腫瘤細胞球，根據文獻報道CD133為肺癌CSCs表面標志[33,34]，采用表面包被CD133抗體的磁珠分離出腫瘤球中CD133陽性的細胞，并采用Western blot檢測CD133陽性細胞中干性標志蛋白Nanog、OCT4和SOX2的表達情況，與CD133陰性細胞相比，CD133陽性細胞中干性標志蛋白的表達均增加，表明分選出的CD133陽性細胞為肺癌CSCs。qRT-PCR檢測發現miR-1在CSCs中表達下調，可能為抑癌因子，進一步在細胞中轉染miR-1 mimic研究miR-1的生物學功能，過表達miR-1后CSCs侵襲和轉移能力降低。miRNAs與其靶基因mRNA的3′非翻譯區(3′-UTR)結合，在轉錄后水平通過使mRNA去穩定化和沉默抑制蛋白質的表達[35,36]，而miRNAs的靶基因可以通過TargetScan7.1軟件預測出，VEGFA是miR-1的靶基因之一，采用熒光素酶報告基因實驗證實VEGFA基因3′-UTR區存在miR-1的結合位點，VEGFA為miR-1直接調控的靶基因。VEGFA屬于VEGF家族，在腫瘤血管生成中發揮重要作用，是最相關的促血管生成因子，其介導的信號傳導促進內皮細胞增殖和遷移，腫瘤血管生成在腫瘤侵襲轉移過程中具有重要促進作用[37,38]。VEGFA在肺癌轉移組織中高表達，敲除VEGFA可減少體內肺癌轉移[39]。VEGFA除可促進血管生成外，還可通過上調SOX2驅動CSCs的擴增，促進CSCs的轉移[40]。miR-1是否通過調控VEGFA抑制肺癌細胞侵襲和轉移引起本課題組的關注，qRT-PCR檢測發現miR-1抑制VEGFA mRNA的表達，Boyden和Transwell實驗結果顯示VEGFA在CSCs中逆轉miR-1對CSCs侵襲轉移的抑制作用。表明miR-1通過靶向負調控VEGFA抑制肺癌CSCs侵襲和轉移。

綜上所述，miR-1于肺癌CSCs中低表達，在CSCs過表達miR-1顯著抑制CSCs的轉移和侵襲，其初步機制可能是miR-1通過負調控VEGFA發揮作用，miR-1可能是肺癌治療的潛在靶點。