血漿miR-145及miR-183對慢性阻塞性肺疾病患者的預后評估價值①

曾宗鼎 邢崇浩 鄭輝才 卓 越 李 鎮(zhèn) 杜 莉 陳 亮 張璐璐

(三亞中心醫(yī)院呼吸科，三亞 572000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以進行性持續(xù)性氣流受限為特征的常見呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率及病死率均較高，給患者和社會帶來了深重的經(jīng)濟負擔，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題[1]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)作為一類新型的基因調控分子，可通過影響靶基因的表達而調控信號通路和炎癥反應，在COPD發(fā)病過程中起重要作用[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-145及miR-183在炎癥性肺疾病中存在異常表達，并發(fā)現(xiàn)了它們作用的靶點，參與了免疫、炎癥的調節(jié)，在COPD的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的調控作用[3，4]。本研究通過分析COPD患者血漿miR-145及miR-183的表達水平，分析其對COPD患者預后評估的價值，旨在為COPD的診斷及靶向治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取2017年1月至2019年2月三亞中心醫(yī)院呼吸科收治的COPD患者208例，男性132例，女性76例，年齡35～82歲，平均年齡(62.50±11.30)歲。納入標準：①符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組修訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》[5]；②結合臨床病史、癥狀及體征確診。排除標準：①合并有嚴重肝腎功能不全、其他肺部疾病及感染者；②長期應用激素者、近期手術、妊娠及哺乳期者；③病歷資料記錄不完整，不能配合本次研究者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.1.2儀器與試劑 總 RNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司(型號:308622);7500型熒光定量 PCR 儀購自美國ABI公司。

1.2方法

1.2.1評價指標及分組 采用回顧性研究方法分析患者入院時的一般資料，包括年齡、性別、體質指數(shù)、基礎疾病、心率、血壓、動脈氧分壓、動脈二氧化碳分壓及第1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)等。根據(jù)患者入院并診斷為COPD為研究起點，COPD患者痊愈出院或死亡作為研究終點。將患者分為存活組(172例)和死亡組(36例)，死亡組中死于呼吸衰竭19例、肺源性心臟病11例、重癥肺炎3例、肺源性腦病3例。按肺功能氣流受限的程度分為：輕度(FEV1占預計值百分比≥80%)9例，中度(50%≤FEV1占預計值百分比<79%)81例，重度(30%≤FEV1占預計值百分比<49%)78例，極重度(FEV1占預計值百分比<30%)40例。

1.2.2miR-145及miR-183檢測 所有患者均于清晨抽取空腹靜脈血5 ml置于抗凝劑離心管中，于室溫2 500 r/min離心15 min，吸取上層血漿 400 μl，加入1 ml提取劑(Trizol)，于-70℃保存。按照總RNA快速提取試劑盒說明書從中提取總RNA。在PCR儀上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)。以U6為內參，miRNA逆轉錄反應體系15 μl∶5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μl 100 mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μl逆轉錄酶(50 U/μl)，1.50 μl 10×反轉錄緩沖液，0.19 μl RNase抑制劑(20 U/μl)，4.16 μl無菌雙蒸餾水。反應條件：16℃ 30 min、42℃ 30 min、85℃ 5 min。擴增反應體系為20 μl∶1 μl 引物及探針Mix(20×)，10 μl TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μl反轉錄產(chǎn)物cDNA，7.67 μl雙蒸餾水。擴增條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s、60℃復性60 s進行45個循環(huán)。每個反應體系中熒光信號達到設定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-145及miR-183的相對表達水平，其中△Ct=Ct(目的基因)-Ct(U6)。

2 結果

2.1存活組和死亡組一般資料比較 兩組的性別、年齡、體質指數(shù)、糖尿病史、高血壓史、冠心病病史、吸煙史、呼吸、心率、收縮壓、舒張壓、動脈血氧分壓及動脈二氧化碳分壓比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。死亡組FEV1占預計值百分比明顯低于存活組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。死亡組動脈二氧化碳分壓明顯高于存活組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2死亡組和存活組血漿miR-145及miR-183表達水平比較 死亡組血漿miR-145及miR-183表達水平均明顯高于存活組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3不同嚴重程度患者血漿miR-145及miR-183表達水平比較 極重度組血漿miR-145及miR-183表達水平均明顯高于重度組和輕-中度組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且重度組血漿miR-145及miR-183表達水平均明顯高于輕-中度組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。極重度組死亡率均明顯高于重度組和輕-中度組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；重度組死亡率與輕-中度組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4血漿miR-145及miR-183水平預測COPD患者死亡的價值 血漿miR-145及miR-183水平預測COPD患者死亡的最佳截斷值分別為4.90、3.42。兩項聯(lián)合預測COPD患者死亡的AUC為0.904(95%CI：0.842～0.965)，明顯高于單項miR-145(0.816，95%CI：0.754～0.872)及miR-183(0.763，95%CI：0.706～0.818)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=5.160、7.204，P<0.05)，其敏感度和特異度為89.5%和84.7%。見表4和圖1。

2.5血漿miR-145及miR-183表達水平與FEV1占預計值百分比的相關性分析 Pearson相關分析顯示，死亡組血漿miR-145及miR-183表達水平與FEV1占預計值百分比均呈負相關(r=-0.847，P<0.01；r=-0.739，P<0.01)，存活組血漿miR-145及miR-183表達水平與FEV1占預計值百分比均無明顯相關性(r=-0.150，P>0.05；r=-0.117，P>0.05)。見圖2。

ItemSurvival group(n=172)Death group(n=36)χ2/tPGender[male,n(%)]106(61.6)26(72.2)1.4410.230Age (year)61.90±10.7463.80±11.601.2180.196Body mass index (kg/m2)23.65±2.5323.40±2.480.6370.608History of diabetes mellitus[n(%)]35(20.3)6(16.7)0.2550.614History of hypertension[n(%)]52(30.2)9(25.0)0.3930.531History of coronary heart disease[n(%)]19(11.0)5(13.9)0.2360.627Smoking history (package/year)38.70±9.3040.50±10.200.5820.650Breathing (times/min)36.20±6.1037.40±6.500.8830.320Heart rate (times/min)116.40±17.80117.80±19.300.9860.295Systolic pressure(mmHg)128.40±12.62130.20±13.700.9750.306Diastolic pressure(mmHg)77.30±9.4078.50±9.820.8170.381Arterial oxygen partial pressure(mmHg)69.60±18.4265.30±15.461.3060.164Arterial carbon dioxide partial pressure(mmHg)50.80±11.3661.72±15.703.5480.025FEV1 accounted for the predicted value51.70±7.4029.80±4.209.164<0.001

GroupsnmiR-145miR-183Survival group1723.82±1.162.75±0.93Death group367.18±2.154.82±1.40t value11.6157.214P value<0.001<0.001

GroupsnmiR-145miR-183Mortality[n(%)]Mild to moderate group902.90±0.96 1.92±0.743(3.3)Severe group784.73±1.381)3.28±1.171)7(9.0)Extremely severe group406.84±1.921)2) 4.50±1.261)2)26(65.0)1)2)F value8.4274.7167.280P value<0.0010.012<0.001

Note：Compared with mild to moderate group,1)P<0.05;compared with severe group,2)P<0.05.

表4 血漿miR-145及miR-183表達水平預測COPD患者死亡的價值

Tab.4 Value of plasma levels of miR-145 and miR-183 in predicting death in COPD patients

ItemOptimumtruncation valueAUC(95%CI)Sensitivity(%)Specificity(%)Positive predictivevalue(%)Negativepredictive value(%)Positivelikelihood ratioNegativelikelihood ratiomiR-1454.900.816(0.754-0.872)80.577.281.476.83.5310.253miR-1833.420.763(0.706-0.818)76.372.875.074.62.8050.326Two Joints-0.904(0.842-0.965)89.584.788.586.45.8500.124

圖1 血漿miR-145及miR-183表達水平預測COPD患者死亡的ROC曲線Fig.1 ROC curve of death in COPD patients predicted by plasma miR-145 and miR-183 expression levels

圖2 血漿miR-145及miR-183表達水平與FEV1占預計值百分比的相關性Fig.2 Correlation between expression levels of miR-145 and miR-183 in plasma and percentage of FEV1 in predicted value

3 討論

COPD是一種復雜的慢性肺部炎癥反應性疾病，其發(fā)病機制涉及多種類型的炎性細胞和各種炎癥介質，急性加重和并發(fā)癥影響疾病的嚴重程度和預后。然而COPD患者缺乏特異性癥狀，目前尚無公認的發(fā)生發(fā)展的相關分子標志物，因此在COPD患者中尋找預測其病情嚴重程度的分子標志物，對COPD的治療和降低COPD的病死率具有重要意義。miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA分子，通過miRNA剪切和抑制蛋白質翻譯的方式參與靶基因的轉錄后調控，在細胞的分化、增殖、凋亡、血管生成以及炎癥免疫反應中發(fā)揮重要作用[6，7]。研究表明，miRNA與COPD的發(fā)生發(fā)展密切相關，持續(xù)性慢性炎癥可引起某些miRNA表達失調、組織修復和重建，這將導致支氣管大、小氣道重構，血管重塑和肺氣腫形成，促發(fā)COPD[8]。亦有研究顯示，miRNA的表達水平可因COPD分期、急性發(fā)作的時間和疾病的嚴重程度等不同而產(chǎn)生差異，這將為COPD的診斷、靶向分子治療及預后評估提供新的策略和方法[9，10]。

本研究顯示，死亡組血漿miR-145及miR-183表達水平均明顯高于存活組，極重度組血漿miR-145、miR-183表達水平及死亡率均明顯高于重度組和輕-中度組，且重度組血漿miR-145及miR-183表達水平均明顯高于輕-中度組。這說明血漿miR-145及miR-183表達水平與COPD患者的病情嚴重程度有關，血漿miR-145及miR-183表達水平升高的COPD患者預后較差，發(fā)生死亡的風險較高。Kara等[11]研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者血清miRNA表達水平明顯升高，且與COPD患者病情嚴重程度和預后密切相關，miRNA能為COPD的診斷、分期及預后提供豐富的信息。Zeng等[12]研究顯示，COPD患者miRNA表達水平升高可能與COPD發(fā)病過程及病情嚴重程度相關，miRNA對預測COPD患者的預后有一定的應用價值。肺功能檢查在COPD的診斷、評估嚴重程度、病情進展及預后中具有重要的意義，它不僅是做出氣流受限診斷的必備條件，還是金標準。目前臨床上主要以FEV1作為COPD診斷、分級和衡量預后的標準[13]。本研究顯示，死亡組FEV1占預計值百分比明顯低于存活組，死亡組血漿miR-145及miR-183表達水平與FEV1占預計值%均呈負相關，這進一步說明了血漿miR-145及miR-183表達水平與COPD患者發(fā)生死亡密切相關。本研究應用ROC曲線分析，結果顯示血漿miR-145及miR-183表達水平預測COPD患者死亡的最佳截斷值分別為4.90和3.42，兩項聯(lián)合預測COPD患者死亡的AUC最大，對預測COPD患者預后具有較高的臨床價值。Tang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過靶向調節(jié)炎癥細胞因子表達，參與COPD的氣道炎癥，可作為COPD病情嚴重程度的生物標志物。陳麗華等[15]研究顯示，miRNA參與多種類型的細胞控制信號通路，并且過表達miRNA可激活促炎細胞因子，引起氣道反復炎癥及重塑，對肺部炎癥有促進作用，提示通過調節(jié)miRNA表達為COPD的診斷和靶向治療提供新的思路。Wang等[16]研究表明，miRNA與COPD的疾病發(fā)展和疾病嚴重性有關，可能為COPD的預后提供新的生物標志物和潛在治療靶點。

綜上所述，血漿miR-145及miR-183表達水平升高與COPD患者病情嚴重程度及預后相關，兩項聯(lián)合檢測對COPD患者預后評估具有較高的價值，有望作為預測COPD預后的新型標志物。但這些研究仍處于初步階段，今后尚需更多的臨床實驗研究來進一步證實miR-145及miR-183在COPD中的應用價值，使其成為COPD靶向治療的新途徑。