miR-485-5p在前列腺癌組織中表達的臨床意義及對前列腺癌細胞生物學行為的影響①

胡海峰 楊 進 陳 林 汪自力 王云漢

(成都大學附屬醫院泌尿外科,成都 610081)

前列腺癌(prostate cancer，PC)是臨床常見泌尿系統惡性腫瘤，其病死率在各類泌尿系統惡性腫瘤中排第二，給患者的生命安全造成巨大威脅[1]。隨著醫療技術的不斷發展，目前PC的治療方案可明顯提高患者生存率，但復發率依然很高，且對于晚期PC患者尚缺乏有效治療手段[2]。因此，尋找更有效的治療方案提升PC患者生存率已成為醫學領域關注的重點。microRNAs(miRNAs)是一種內源性非編碼RNA，在轉錄后可通過調控靶基因的表達，在腫瘤細胞生長發育、增殖分化及腫瘤發生與發展中發揮重要作用[3]。

miR-485-5p是miRNAs家族成員之一，為新發現的抑癌基因在多種腫瘤細胞中低表達，與胃癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發生與發展顯著相關，因此miR-485-5p具有成為惡性腫瘤防治新靶點的潛質[4,5]。但是，目前鮮見miR-485-5p在PC組織中表達及其生物學功能的研究。為此，本研究分析PC組織及細胞中miR-485-5p的表達，并通過細胞實驗探究miR-485-5p對PC生物學行為的影響，闡述miR-485-5p在PC防治中的應用價值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病理組織及細胞系 收集本院病理科2014年4月至2018年5月存檔的石蠟包埋PC組織及其匹配癌旁組織(距離手術邊緣>2 cm)45例。所有患者均經病理學診斷為PC，術前均未接受任何形式放化療治療。人PC細胞系LNCaP、22RV1、PC-3 來源于上海 ATCC 細胞庫。

1.1.2實驗試劑及儀器 DEME細胞培養基(美國Life Technology公司)；胰酶、胎牛血清(美國ScienCell公司)；TRIzol 試劑盒(美國 Invitrogen 公司)；miR-485-5p類似物(mimic)及陰性對照空載體質粒(上海吉瑪生物公司)；兩步法RNA提取試劑盒(Fermentas公司)；恒溫細胞培養箱(美國Thermo公司)；酶標儀(上海賽默飛世爾公司)；離心機(意大利A.L.C 公司)、流式細胞儀(美國FCMXBD公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR檢測miR-485-5p表達 采用TRIzol 試劑盒提取PC組織、癌旁組織及各PC細胞系中總RNA，逆轉錄成cDNA。選擇待檢測基因的合適上下游引物，以cDNA為模板，PCR擴增待檢測基因。以GAPDH為內參，擴增結束后繪制溶解曲線，采用2-ΔΔCt計算各組組織及細胞中miR-485-5p相對表達量。

1.2.2細胞轉染 將PC細胞系中miR-485-5p表達最低的細胞系(LNCaP)分散于細胞培養基，接種于6孔板，調整細胞密度為2×106個/孔，置于恒溫細胞培養箱中孵育。將細胞分為miR-485-5p mimic組(miR組)和陰性對照組(NC組)。轉染前24 h接種細胞，將miR-485-5p mimic轉染于miR組細胞中，將對照空載質粒轉染至NC組細胞，按照轉染試劑盒操作步驟進行轉染。

1.2.3MTT實驗檢測細胞增殖 取處于對數生長期的miR組及NC組細胞，制備密度為1×105個/ml的細胞懸液，接種于96孔板，200 μl/孔，每組設置6個復孔，置于恒溫細胞培養箱中孵育，分別培養24、48、72 h后，加入15 μl MTT溶液(質量濃度為5 mg/ml)，37℃孵育4 h。棄上清，各孔加入100 μl DMSO溶解MTT結晶，輕輕振蕩，10 min后酶標儀測OD值(λ=490 nm)，并計算細胞增殖率。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞轉染24、48及72 h后，采用PBS清洗細胞，離心后去上清。按照試劑盒說明書操作：用緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC 染色，并于暗處室溫孵育15 min，再加入5 μl PI染色，靜置5 min后用流式細胞儀檢測其凋亡情況。每組重復3次計算平均值。

1.2.5劃痕實驗檢測細胞遷移 細胞轉染24、48及72 h后，收集各組處于對數期生長的LNCaP細胞，置于恒溫細胞培養箱(37℃、5%CO2)中孵育，待細胞融合率達到90%時，采用槍頭(200 μl)垂直于6孔板底部做橫線劃痕，倒置熒光顯微鏡觀察劃痕區域寬度并拍照。隨后繼續置于培養箱(37℃、5%CO2)中孵育24 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察劃痕區域寬度變化并拍照。采用ImageJ軟件測量劃痕區域寬度，并計算各組細胞相對應的細胞劃痕愈合率，每組細胞設置3個復孔，取平均值。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞侵襲 取100 μl稀釋完成的基質膠均勻覆蓋于Transwell小室底部。細胞轉染24、48及72 h后，分別取各組對數期生長的LNCaP細胞，胰酶消化后將細胞濃度調至2×105個/ml。取100 μl細胞懸液加于上室，下室加入等量含血清培養基，培養48 h后取出，按照說明書進行固定、染色，膜的下室面表面細胞為侵襲細胞，顯微鏡下拍照、計數，共計數5個視野，取平均值。

2 結果

2.1PC組織及細胞中miR-485-5p表達 PC組織中miR-485-5p相對表達量明顯低于癌旁組織(Control)(P<0.05，圖1)。在3種PC細胞系中，LNCaP細胞中miR-485-5p相對表達量最低，將其作為后續細胞學實驗的細胞株。

2.2miR-485-5p表達水平與PC患者病理參數的關系 PC組織中miR-485-5p相對表達量為0.62±0.09，以此為分界點，將45例PC組織分為高表達組(18例)及低表達組(27例)。收集兩組患者的各項臨床資料，發現PC組織中miR-485-5p低表達與淋巴結轉移、高臨床病理分級(G3)及高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)相關(P<0.05)。見表1。

2.3轉染對LNCaP細胞miR-485-5p相對表達水平及增殖抑制的影響 轉染24 h、48 h及72 h后miR組miR-485-5p相對表達量均明顯高于NC組(P<0.05，圖2A)。隨著孵育時間延長，miR組細胞抑制率明顯升高(P<0.05)，且各時間點miR組細胞抑制率明顯高于NC組(P<0.05，圖2B)。

2.4轉染miR-485-5p對LNCaP細胞凋亡的影響 隨著孵育時間延長，miR組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，且各時間點miR組細胞凋亡率明顯高于NC組(P<0.05，圖3)。

2.5轉染miR-485-5p對LNCaP細胞遷移的影響 隨著孵育時間延長，miR組及NC組細胞劃痕愈合率明顯升高(P<0.05)，且各時間點NC組劃痕愈合率明顯高于miR組(P<0.05，圖4)。

2.6轉染miR-485-5p對LNCaP細胞侵襲的影響

表1 miR-485-5p表達與PC患者病理參數的關系

Tab.1 Relationship between miR-485-5p expression and pathological parameters of patients with PC

ClinicopathologicparamentersClassificationmiR-485-5pHigh expressionLow expressionχ2PAge≦608140.2370.626>601013BPHYes9150.1340.714No912Histopathological classificationG1-G24177.2020.007G31410Lymphatic metastasisYes52111.0680.001No136TNM stageⅠ+Ⅱ1074.5250.033Ⅲ+Ⅳ820

圖1 PC組織及細胞中miR-485-5p的表達Fig.1 miR-485-5p expressions in PC tissues and cells

圖2 轉染不同時間后各組細胞miR-485-5p相對表達量比較及增殖抑制率比較Fig.2 Comparison of relative expression of miR-485-5p and inhibition rates of cells in each group after transfection for different timeNote: Compared with NC group,*.P<0.05.

圖3 轉染不同時間后各組細胞凋亡率比較Fig.3 Comparison of apoptosis rates of cells in each group after transfection for differnt timeNote: Compared with NC group,*.P<0.05.

圖4 各組細胞劃痕愈合率比較Fig.4 Comparison of cell scratch healing rates in each groupNote: Compared with NC group,*.P<0.05.

圖5 各組細胞侵襲細胞數比較Fig.5 Comparison of number of invasive cells in each groupNote: Compared with NC group,*.P<0.05.

隨著孵育時間延長，miR組及NC組侵襲細胞數增多(P<0.05)，且各時間點NC組侵襲細胞數明顯高于miR組(P<0.05，圖5)。

3 討論

PC的發生及發展是十分復雜的生物學過程，有多種基因參與調節。既往研究證實，miRNA可用于PC的診斷與治療，異常表達miRNA譜可用于預測PC患者術后復發情況，從PC組織中異常表達的miRNA入手可能有助于闡明PC的發病機制，找到新的治療靶點[6,7]。miR-485-5p是新發現的抑癌基因，可通過調節靶向基因發揮其生物學功能，參與乳腺癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發生發展[8]。Sun等[9]研究發現，miR-485-5p在肝癌細胞中可通過靶向結合STC2下調其蛋白表達水平，進而發揮抑制肝癌細胞增殖的作用。Wang等[10]通過細胞實驗證實，miR-485-5p在乳腺癌細胞中低表達，上調miR-485-5p表達水平可明顯抑制乳腺癌細胞的侵襲及遷移。本研究中，相較于癌旁組織，PC組織中miR-485-5p表達量明顯降低，提示miR-485-5p與PC的發生發展相關。Yang等[11]也通過對比研究證實PC組織中miR-485-5p表達量明顯低于正常前列腺組織，與本研究結果一致。為探究miR-485-5p在PC防治中的價值，本研究進一步分析miR-485-5p與PC患者各項病理參數的關系，結果顯示miR-485-5p表達水平與淋巴結轉移、臨床病理分級及TNM分期相關，存在淋巴結轉移、臨床病理分級高及TNM分期晚的患者miR-485-5p表達水平明顯降低，提示miR-485-5p可能通過參與PC惡變、生長及轉移，發揮抑癌作用。

增殖能力增強、凋亡減少及遷移與侵襲能力的提升是腫瘤常見的生物學特性，亦是腫瘤生長、復發及轉移的基礎[12]。多項研究表明，miRNA在參與腫瘤細胞的發生發展過程時，可調節腫瘤細胞的各項生物學行為，包含增殖、凋亡、侵襲及遷移等[13]。Kang等[14]研究顯示，miR-485-5p在胃癌細胞中的表達量明顯降低，其可通過負向調控FLOT1抑制胃癌細胞的增殖、侵襲及轉移。而Wu等[15]研究證實，miR-485-5p可通過負向調控FZD7進而抑制黑色素瘤的侵襲及增殖，且其過表達后可明顯抑制Wnt信號通路，從而發揮抑癌作用。目前，miR-485-5p對PC細胞各類生物學行為的影響尚不明確。本研究所檢測的3類PC細胞系中LNCaP細胞miR-485-5p表達量最低，因此本研究選用LNCaP細胞，通過各項生物學細胞實驗探究miR-485-5p對PC細胞生物學行為的影響。轉染后，miR組細胞miR-485-5p表達量明顯高于其他組，說明miR-485-5p轉染成功，可用于后續實驗。研究發現，轉染miR-485-5p可明顯抑制LNCaP細胞增殖，并誘導細胞凋亡，說明miR-485-5p在PC患者中的抑癌作用可能是通過抑制癌細胞增殖并誘導凋亡實現的。Yang等[16]研究發現，miR-485-5p可直接與PC細胞中RBM5的3′UTR結合，通過提升RBM5的表達量抑制PC細胞增殖，并促進其凋亡這可能是miR-485-5p抑制PC發展的作用機制。國內外大量研究證實，侵襲及轉移是影響腫瘤患者復發及生存期長短最主要的因素，抑制腫瘤細胞的侵襲及遷移是降低復發率、延長生存時間的關鍵[17-19]。本研究對各PC患者的臨床資料分析結果顯示，低表達miR-485-5p的患者發生淋巴結轉移的幾率明顯增大，提示miR-485-5p與PC細胞發生轉移密切相關，而提升miR-485-5p表達可顯著抑制轉移的發生。此外，本研究發現細胞轉染miR-485-5p后，其細胞侵襲及遷移能力均明顯降低，進一步說明miR-485-5p可抑制PC細胞的侵襲及遷移。Yang等[20]研究顯示，通過提升PC細胞中miR-485-5p的表達，可明顯抑制細胞增殖，并降低其發生轉移的概率，與本研究結果一致。研究結果表明miR-485-5p具有抑制PC細胞增殖、侵襲及遷移，并促進凋亡的作用，可抑制腫瘤的發生發展，可能作為一種抑癌基因在PC中發揮重要的生物學作用。

綜上所述，PC組織及細胞中miR-485-5p表達水平降低，且與病理分級、TNM分期及淋巴結轉移等臨床病理參數相關，采用細胞轉染技術上調miR-485-5p水平可明顯抑制PC細胞增殖、遷移及侵襲，并誘導其凋亡，在PC的防治中具有較大的潛能。但是，研究顯示miRNA并不具有蛋白質編碼功能，是通過靶向下游基因發揮其生物學功能。因此，本研究中只是初步探討miR-485-5p在PC中的表達及生物學功能，而其具體的下游靶基因及相應的作用機制將作為后續研究。