茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

張?jiān)娙狗疲糗偏h，曾百慧，王茜，吳鵬*

黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院，經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心（黃岡 438000）

茯苓（Poria cocos）又稱茯靈，屬多孔菌科[1]。我國(guó)森林資源非常豐富，很多地域具有海拔高、晝夜溫差大、雨水量充沛的特點(diǎn)，適宜真菌類中藥材種植和生長(zhǎng)[2]。茯苓作為中國(guó)傳統(tǒng)藥材，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、消炎利尿等作用[3]。隨著茯苓研究深入[4]，茯苓及其提取物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和保健品研發(fā)[5]。因此，消費(fèi)者對(duì)于茯苓的需求量不斷增加[6]，使得茯苓具有廣闊市場(chǎng)前景[7]。

中國(guó)對(duì)于茯苓的培養(yǎng)仍以人工栽培的傳統(tǒng)方法為主[8]，存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、效益低、局限于地理?xiàng)l件[9]、不能夠確保茯苓藥性等諸多問(wèn)題[10]，不符合現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)要求[11]，不利于茯苓資源開發(fā)。而茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)具有周期短、成本低、工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量大的優(yōu)勢(shì)[11-14]，采用茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)獲得的茯苓與人工栽培的茯苓具有相同功效，還能獲得標(biāo)準(zhǔn)化茯苓以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求[15]，茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)將成為茯苓資源開發(fā)趨勢(shì)[16-17]。

試驗(yàn)以茯苓菌絲體干質(zhì)量作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，用液體發(fā)酵培養(yǎng)法對(duì)茯苓菌進(jìn)行培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)天數(shù)為影響因素，通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)茯苓提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

茯苓菌（甘油管保藏-30℃）。

葡萄糖、硝酸鈉、無(wú)水氯化鈣、維生素B1（VB1）、磷酸氫二鉀、硫酸鎂（均為分析純）；蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子液體培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨7.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，在121℃條件下滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，硫酸鎂1.67 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨30 g/L，硝酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，VB11 g/L，無(wú)水氯化鈣0.1 g/L，在121℃條件下滅菌20 min[18]。

1.2 儀器與設(shè)備

LX-B 50L型立式自動(dòng)電熱壓蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；RB-CJ-1 ND型超凈工作臺(tái)（北京瑞邦興業(yè)科技有限公司）；SPX-150生化培養(yǎng)箱（中儀國(guó)科（北京）科技有限公司）；TG 16-WST臺(tái)式高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；D2F-6020真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；AL 204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）股份有限公司）；SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（常州國(guó)華電器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化、純化及種子液

活化。將甘油保藏的茯苓菌用37℃水浴2 h，將水浴后的茯苓菌用無(wú)菌移液槍按2%接種量種于種子液體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行液體發(fā)酵，在26.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

純化。把活化后的菌種按10%接種量接種于250 mL種子液體培養(yǎng)基中，在26.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。3 d后重復(fù)此操作以得到純度高的菌種進(jìn)行培養(yǎng)和后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

種子液。將50 mL種子液體培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，在超凈工作臺(tái)中按5%接種量無(wú)菌接種，置于26.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，作為菌體菌種備用。

1.3.2 菌體量的測(cè)定

將所得發(fā)酵液，導(dǎo)入離心管中以4 000 r/min離心20 min，去上層清液，將剩于物質(zhì)置于45℃真空干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，以干菌體量表示生物量[19]。

1.3.3 茯苓液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)的研究

將50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，按5%接種量接入已培養(yǎng)好的菌種，用恒溫水浴搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)3 d。

接種量對(duì)茯苓液體發(fā)酵的影響。依此以3%，5%，7%，9%和11%接種量在水浴溫度26℃、振蕩速度150 r/min條件下培養(yǎng)3 d，測(cè)定各三角瓶菌體量，確定茯苓液體發(fā)酵最適接種量。

培養(yǎng)天數(shù)對(duì)茯苓液體發(fā)酵的影響。以5%接種量在水浴溫度26℃、振蕩速度150 r/min條件下依此培養(yǎng)2，3，4，5和6 d，測(cè)定各三角瓶菌體量，確定茯苓液體發(fā)酵最適培養(yǎng)時(shí)間。

搖瓶溫度對(duì)茯苓液體發(fā)酵的影響。以5%接種量在水浴溫度分別為24，25，26，27和28℃，振蕩速度150 r/min條件下培養(yǎng)3 d，測(cè)定各三角瓶菌體量，確定茯苓液體發(fā)酵最適培養(yǎng)溫度。

1.3.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得到Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)，以相鄰的上下2個(gè)梯度為高低水平，以菌體量（Y）為響應(yīng)值，對(duì)茯苓菌體量的影響因素培養(yǎng)溫度（A）、接種量（B）、培養(yǎng)天數(shù)（C）進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到最優(yōu)方案。響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)溫度對(duì)茯苓液體發(fā)酵的影響

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲體干質(zhì)量有較大影響，達(dá)到26℃前，隨著溫度升高，菌絲體干質(zhì)量不斷增加，在26℃時(shí)由最大菌絲體干質(zhì)量，為7.34 g/L；溫度大于26℃后，菌絲體干質(zhì)量逐漸下降。由于在不同溫度下微生物有不同生理活性，因而確定最適培養(yǎng)溫度26℃。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)茯苓液體發(fā)酵的影響

2.1.2 接種量對(duì)茯苓液體發(fā)酵的影響

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著接種量增加，菌絲體干質(zhì)量增加，接種量5%～7%時(shí)，菌絲體產(chǎn)量較高，5%時(shí)菌絲體干質(zhì)量為5.02 g/L達(dá)到峰值，綜合考慮培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短和生產(chǎn)成本等因素后，確定最適接種量5%。

2.1.3 培養(yǎng)天數(shù)對(duì)茯苓液體發(fā)酵的影響

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。培養(yǎng)天數(shù)對(duì)菌絲體干質(zhì)量有較大影響，培養(yǎng)天數(shù)4～6 d時(shí)有較高菌絲體干質(zhì)量，并且在5 d時(shí)達(dá)到最大值7.4 g/L，培養(yǎng)天數(shù)大于5 d時(shí)菌絲體干質(zhì)量開始下降，綜合考慮成本后，選擇最適培養(yǎng)天數(shù)5 d。

圖2 不同接種量對(duì)茯苓液體發(fā)酵的影響

圖3 不同培養(yǎng)天數(shù)對(duì)茯苓液體發(fā)酵的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0軟件，以菌絲體干質(zhì)量為（Y）作為響應(yīng)值，對(duì)培養(yǎng)溫度（A）、接種量（B）和培養(yǎng)天數(shù)（C）3個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

將各因素使用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合后，得到茯苓菌絲體干質(zhì)量響應(yīng)面回歸模擬方程：Y=7.34+0.044A-0.35B-0.16C-0.36AB+0.91AC+1.37BC+0.78A2-0.64B2-2.01C2。

由表3可知，該模型的p=0.000 1＜0.01，極顯著；失擬項(xiàng)p=0.077 0＞0.05，不顯著，表明該方程合理可靠。一次項(xiàng)B對(duì)結(jié)果影響顯著（p＜0.05），A、C對(duì)結(jié)果影響不顯著（p＞0.05），交互項(xiàng)AC、BC對(duì)結(jié)果影響極顯著（p＜0.01），AB對(duì)結(jié)果影響不顯著（p＞0.05），二次項(xiàng)A2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（p＜ 0.01），B2對(duì)結(jié)果影響顯著（p＜0.05）。3個(gè)單因素對(duì)菌絲體干質(zhì)量的影響主次順序?yàn)锽＞C＞A，即：培養(yǎng)天數(shù)＞接種量＞培養(yǎng)溫度。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

由響應(yīng)面分析法求得茯苓菌發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件為：培養(yǎng)溫度27℃、接種量3.86%、培養(yǎng)天數(shù)4.99 d。理論得到菌絲體干質(zhì)量為8.358 78 g/L。考慮試劑操作方便，將各因素修正為：培養(yǎng)溫度27℃、接種量4%、培養(yǎng)天數(shù)5 d。

2.2.2 響應(yīng)分析

培養(yǎng)溫度、接種量及培養(yǎng)時(shí)間的交互作用對(duì)菌絲體干質(zhì)量影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖4。

圖4直觀反映影響菌絲體干質(zhì)量的3個(gè)因素兩兩交互作用，隨著培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和接種量增加，菌絲體干質(zhì)量呈先升高后下降趨勢(shì)，在所采用數(shù)值間均有極值出現(xiàn)。沿接種量（B）方向比培養(yǎng)天數(shù)（C）的響應(yīng)面坡度更陡，等高線也更密集，說(shuō)明接種量對(duì)茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響大于培養(yǎng)天數(shù)，與方差分析結(jié)果一致；培養(yǎng)天數(shù)（C）方向比培養(yǎng)溫度（A）的響應(yīng)面坡度更陡，說(shuō)明培養(yǎng)天數(shù)對(duì)茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響大于培養(yǎng)溫度，與方差分析結(jié)果一致。

圖4 培養(yǎng)溫度、接種量及培養(yǎng)時(shí)間的交互作用對(duì)菌絲體干質(zhì)量影響的響應(yīng)面及等高線

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在由響應(yīng)面分析法求得的茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，通過(guò)3次平行試驗(yàn)，得出實(shí)際菌絲體干質(zhì)量為8.329±0.032 g/L，與回歸方程預(yù)測(cè)值8.358 78 g/L基本吻合，所以該模型有效。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)不僅和菌種基因等內(nèi)在因素有關(guān)，也與菌體培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量等外在條件有關(guān)。試驗(yàn)以茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)后菌絲體干質(zhì)量為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面對(duì)茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)的條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果表明，接種量顯著影響茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)的結(jié)果。得出最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度27℃、接種量4%、培養(yǎng)天數(shù)5 d。接種量和培養(yǎng)天數(shù)的交互作用、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)天數(shù)的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響均顯著，但是接種量和培養(yǎng)溫度的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，后續(xù)研究可考慮更換培養(yǎng)溫度這一條件，以期得到最佳茯苓液體發(fā)酵培養(yǎng)條件，為茯苓液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。