QuEChERS-HPLC-Q-TOF/MS快速篩查蔬菜中32種農藥殘留

楊明，涂鳳琴，王冬梅，伊鋆，江小明*，宮智勇

1. 武漢食品化妝品檢驗所（武漢 430012）；2. 武漢輕工大學食品科學與工程學院（武漢 430023）

隨著經濟水平的提升，人們對蔬菜的質量要求也不斷增加。然而，農業生產中普遍存在的農藥殘留問題勢必給人們的身體健康造成較大威脅[1]，引起了各國政府和國際組織對農藥殘留問題的重視。加強農藥管理離不開對農藥殘留的監督和篩查，故建立農藥多殘留的快速篩查方法對于保障農產品的質量安全具有重要意義。目前，蔬菜農藥殘留的測定方法主要有氣相色譜（Gas chromatography，GC）法[2]、氣相色譜-質譜聯用（Gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）法[3]、液相色譜（Liquid chromatography，LC）法[4]和液相色譜-質譜聯用（Liquid chromatographmass spectrometery，LC-MS）法[5]等。由于檢測農藥種類較多、基質復雜，單一的GC和LC的定性能力較弱，很難滿足農藥多殘留的檢測需求，而GC-MS和LC-MS均為低分辨質譜，在分析復雜基質樣品時也易出現假陽性的情況，造成結果誤判[6]。四極桿-飛行時間質譜（Quadrupole-time of flight mass spectrometry，Q-TOF/MS）等高分辨質譜技術因其具有高分辨率、高精度、全質量數據采集和無需標準物質定性等優勢[7]，被越來越多地應用于農藥篩查領域，為農藥合理科學的使用提供了良好的檢測手段[8]。在前處理技術方面，傳統的前處理方法主要有液液萃取、固液萃取等。這些方法存在溶劑耗量大、操作較為繁瑣等缺點。QuEChERS前處理技術由于其具有操作簡單、便捷高效、溶劑用量小等特點，已被廣泛應用于食品中農藥殘留的分析檢測[9-10]

試驗建立了QuEChERS-高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（QuEChERS-HPLC-Q/TOF MS）快速篩查與確證蔬菜中32種農藥殘留的分析方法。該方法僅需一次數據采集、建立譜庫，通過檢索即可同時完成目標物的定性篩查和確證分析，縮減了前處理和檢測時間，實現了無標準品情況下對蔬菜樣品中32種農藥的快速篩查和確認，同時可對檢測到的目標物進行準確定量，有效提升了農藥多殘留的檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

32種農藥標準品均為First Standard品牌標準品，且均購于天津阿爾塔科技有限公司，純度均≥98.0%；乙酸乙酯、丙酮、乙腈、乙酸銨（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）：上海安譜科學儀器公司；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；超純水（18.2 MΩ·cm，由Milli-Q超純水系統制得）。蔬菜樣品從市場上隨機抽取。

1.2 儀器與設備

SCIEX X500R四極桿飛行時間質譜儀（配有可用于電噴霧電離的Turbo V離子源，美國AB SCIEX公司）；LC 30A液相色譜儀（日本島津公司）；Allegra X-15R Centrifuge離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；Vortex-Genie2渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；PM5-2000TL超聲波清洗器（普律瑪儀器公司）；Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）；ME204/02電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（英國Genevac公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

分別準確稱取適量各農藥標準品，根據農藥分子的溶解度和測定需要選擇甲醇、乙腈等溶劑溶解，配制質量濃度約為10 μg/mL的標準儲備液，于-18℃保存。根據需要，移取適量的標準儲備液，用空白樣品基質提取液配制系列濃度的基質匹配標準工作溶液，基質匹配標準溶液現用現配。

1.3.2 樣品處理

稱取5.0 g勻漿后的樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取30 min，加入3 g氯化鈉，以4 500 r/min離心5 min，上清液待凈化。取全部上清液置于含200 mg PSA、100 mg C18吸附劑的15 mL具塞離心管中，渦旋振蕩2 min，以4 500 r/min離心5 min，取5 mL上清液于試管中，于40℃旋轉濃縮至近干，用1.0 mL乙腈-0.1%甲酸水（9+1，V/V）復溶，經0.22 μm濾膜過濾后，供HPLC-Q-TOF/MS檢測。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）。柱溫：40℃。進樣量：5 μL。流速：0.3 mL/min。流動相A：5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水。流動相B：5 mmol/L乙酸銨-甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，5.0% B；0.5～3.0 min，70% B；3.0～6.0 min，90.0% B；6.0～9.0 min，90.0% B；9.0～9.5 min，90.0%～5.0% B；9.5～12 min，5.0% B。

1.3.3.2 質譜條件

離子源：Turbo V ESI源。掃描方式：正離子掃描。檢測方式：TOF MS-IDA-MS/MS。離子源溫度：550℃。電噴霧電壓（IS）：4 500 V。霧化氣壓力（GS1）：50 psi。輔助氣壓力（GS2）：55 psi。氣簾氣壓力（CUR）：35 psi。碰撞氣（CAD）：7 psi。TOF-MS參數為采集范圍：m/z100～1 000。去簇電壓（DP）：60 V。累計時間：0.25 s。TOF-MS/MS參數采集范圍：m/z50～1 000。碰撞能量（CE）：35 V。累計時間：0.05 s。碰撞能量波動范圍（CES）：15 V。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

試驗選擇Waters XBridge C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）色譜柱對32種目標化合物進行分離分析，并比較32種農藥在乙腈-水與甲醇-水流動相體系中的色譜分離效果。結果表明，目標化合物在甲醇-水流動相體系中分離度較好。進一步考察在水相和有機相中添加不同含量的甲酸、乙酸銨對分離效果的影響。結果顯示，目標化合物在5 mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水-5 mmol/L乙酸銨/甲醇流動相體系下的分離度高、保留較好且質譜響應高，因此采用5 mmol/L乙酸銨/ 0.1%甲酸水-5 mmol/L乙酸銨/甲醇作為流動相。

2.2 質譜數據庫的建立

32種目標化合物的母離子在正離子模式下的加合形式均為 [M+H]+。在優化的色譜-質譜條件下，對32種農藥混合標準溶液進行TOF MS-IDA-MS/MS掃描。在采集一級質譜信息的同時，當化合物響應值超過設定的閾值，信息相關掃描（Information Dependent Acquistion，IDA）自動觸發TOF MS/MS掃描采集目標物的二級碎片離子信息。TOF MS-IDA-MS/MS掃描模式僅需一次數據采集，即可獲得目標物的精確質量母離子、保留時間等一級質譜信息以及在三個碰撞能量（20，35和50 V）下采集并疊加的二級碎片離子信息。通過SCIEX OS軟件輸入每種農藥分子的名稱、分子式、精確相對分子質量、保留時間，建立32種農藥的一級精確質量數據庫，并將相應的二級碎片離子質譜圖導入譜庫，建立32種農藥分子的二級質譜信息庫。32種農藥的分子式、保留時間、理論分子量和實際測得分子量等質譜信息見表1。

表1 32種農藥的分子式、保留時間、理論分子量、實際測得分子量和其他質譜參數

2.3 提取試劑優化

試驗以50 ng/mL標準添加樣品對提取溶劑的種類進行考察。根據32種農藥化學性質，選用乙酸乙酯、丙酮、乙腈作為提取溶劑并比較其提取效率。結果發現，乙酸乙酯和丙酮提取液的水分較多且顏色較深，會干擾目標物的分析、損害色譜柱、污染質譜離子源，且乙酸乙酯和丙酮對32種農藥的提取平均回收率分別為62.82%和67.79%，其中乙酸乙酯中氯唑磷、噻螨酮、硫線磷、氟吡甲禾靈、蟲酰肼、肟菌酯、霜霉威、四螨嗪、炔苯酰草胺、啶酰菌胺、乙霉威、辛硫磷、嘧菌酯、噁唑菌酮、氯吡脲和氟酰脲等16種的回收率均低于59.24%，丙酮中吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲啉、呋蟲胺、殺線威、噁唑菌酮和氟酰脲等8種農藥的回收率均低于59.19%?？傮w來看，乙腈的提取效果最好，提取液顏色較淺，32種農藥平均回收率為88.54%，均在70%～110%之間，滿足試驗要求，因此選擇乙腈作為提取試劑。在50 ng/mL標準添加樣品條件下，不同提取溶劑對蔬菜中32種農藥的提取回收率如圖1所示。

2.4 吸附劑的選擇

蔬菜樣品基質中含有較多的糖類、有機酸、色素、維生素、芳香物質等，這些物質可能會和目標農藥一起被提取出來，若不進行凈化除雜，不僅會干擾目標物的分析，而且會損害色譜柱，污染質譜離子源。QuEChERS法經常使用的吸附劑有PSA、C18和GCB等，可有效去除基質中的有機酸、糖類和色素等多種組分。GCB對多菌靈和噻菌靈等平面農藥具有很強的吸附作用，回收率低[11]，因此不使用該吸附劑。試驗研究了100 mg PSA+50 mg C18，150 mg PSA+75 mg C18，200 mg PSA+100 mg C18和250 mg PSA+125 mg C18四種不同凈化劑組合對農藥回收的影響。結果表明（圖2）：在50 ng/mL標準添加樣品條件下，200 mg PSA+100 mg C18吸附劑組合的凈化效果最好，對32種農藥的平均回收率為88.47%，且各農藥的回收率均在73.55%～102.67%之間。因此，選擇200 mg PSA+100 mg C18吸附劑組合作為最佳純化方案。

圖1 不同提取溶劑對蔬菜中32種農藥的提取效率

圖2 不同吸附劑對蔬菜中32種農藥回收率的影響

2.5 基質效應

基質效應（Matrix Effect，ME）是指目標分析物以外的其他組分對分析信號引起的增強或抑制現象[12]。試驗用不同蔬菜的空白基質提取液與純溶劑分別配制系列濃度的混合標準工作溶液，通過比較標準曲線的斜率來評價基質效應。計算公式：ME=基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率[13]。當ME為0.80～1.20時，基質效應不明顯；當ME＞1.20時，存在基質增強效應；當ME＜0.80時，存在基質抑制效應。結果表明：以韭菜為例，32種農藥中21種農藥的ME在0.80～1.20范圍內，11種農藥的ME在0.70～0.80之間，存在一定的基質抑制效應。因此，采用基質匹配標準工作溶液作校準曲線來降低基質效應對測定結果的影響。

2.6 方法學考察

用空白基質提取液配制系列濃度的32種農藥混合標準工作溶液，縱坐標以峰面積（y）計，橫坐標以質量濃度（x）計，繪制基質標準工作曲線。結果表明，32種目標化合物濃度與對應的峰面積呈現良好的線性關系，線性相關系數（r）均大于0.999 0。檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別以3×和10×信噪比（S/N）計，該方法32種農藥的檢出限在0.3～1.3 μg/kg之間，定量限在1.0～4.0 μg/kg之間。在陰性樣品中添加3個濃度水平（n=6）的混合標準溶液以檢查該方法的回收率和精確度。32種目標化合物的平均回收率為70.41%～103.1%，相對標準偏差為1.2%～11.2%，該方法回收率高、精密度高，滿足蔬菜中農藥殘留監測的要求。

2.7 實際樣品分析

采用所建立的方法對市售的20批次蔬菜樣品進行分析，其中4批次樣品中檢出啶蟲脒、多菌靈、烯酰嗎啉、啶酰菌胺和嘧菌酯等5種農藥殘留。通過檢索質譜信息數據庫進行定性篩查，當可疑陽性化合物的一級精確質量數、同位素分布、保留時間等信息與數據庫中目標農藥分子匹配時，再通過二級全掃描質譜圖的匹配度進行確證。以某一陽性樣品中檢出的啶蟲脒為例，疑似化合物的保留時間與數據庫信息一致，一級精確質量數偏差＜5 μg/mL二級全掃描質譜圖與數據庫中啶蟲脒二級碎片質譜圖的鏡像比對匹配度＞80%，該化合物被確證為啶蟲脒。樣品中啶蟲脒的提取離子色譜圖、TOF-MS和TOF-MS/MS質譜圖如圖3所示。

對篩查出的目標物通過采用基質匹配外表法進行準確定量，4批次陽性樣品中檢出的5種農藥殘留，均未超過GB 2763—2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》規定的最大殘留限量。同時，采用相對應國家標準對上述陽性樣品進行了測試，驗證了該方法的準確性，結果與該方法測定的結果一致。具體結果見表2。

圖3 某陽性樣品中啶蟲脒的提取離子色譜圖、TOF-MS和TOF-MS/MS質譜圖

表2 實際陽性樣品檢測結果

3 結論

試驗以QuEChERS前處理技術結合高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜檢測技術，建立了快速篩查蔬菜中32種農藥殘留的分析方法。利用該方法建立的一級精確質量數據庫和二級全掃描質譜信息庫，無需標準品即可實現蔬菜中32種農藥殘留的快速篩選和準確測定。實際樣品檢驗中進一步證明該方法簡便、快速、高效、準確可靠，可用于蔬菜質量安全風險評估中多種類農藥殘留的快速篩查分析，同時也對蔬菜農藥殘留的監測具有較高的實用價值。